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Crónicas de autores

Granada, España (especial para SIIC):
El diagnóstico precoz de fibrosis quística (FQ) aporta indudables beneficios;^1-3 sin embargo, en todos los casos es necesario un cuidadoso estudio que incluya el análisis de tripsinógeno y estudio múltiple de las mutaciones más frecuentes de FQ, incluyendo aquellos alelos que sean más frecuentes teniendo en cuenta la población que se está estudiando. Existen varios estudios^4,5 en los cuales se pone de manifiesto que la población mediterránea es la región que presenta mayor grado de heterogeneidad en relación con las mutaciones descritas en el gen CFTR y responsables de FQ.
En este artículo describimos el desarrollo de un análisis para el estudio en multiplex de once mutaciones frecuentes en la población española. La selección de estas mutaciones se llevó a cabo teniendo en cuenta el estudio publicado por Casals y col., en 1997,⁶ acerca de la incidencia de distintas mutaciones en la población española.
El análisis de las mutaciones del gen CFTR se llevó a cabo en 140 muestras de pacientes diagnosticados con FQ en el Hospital 12 de Octubre (Madrid, España), en el IRO, Hospital Duran I Reynals (Barcelona, España) o bien referidos al Hospital Universitario San Cecilio (Granada, España). El ADN genómico fue extraído de muestras de sangre entera y su concentración fue determinada espectrofotométricamente.
El ensayo genético de FQ desarrollado comprende una primera reacción de amplificación mediante PCR de los exones o intrones seleccionados que contiene las mutaciones a estudiar, seguida de una reacción de extensión de un único nucleótido a partir de un cebador. Los cebadores que amplifican las regiones que contienen los polimorfismos estudiados (primera reacción de amplificación por PCR) fueron diseñados para amplificar los exones 17b, 15, 13, 10 y 6a, así como el intrón 11 del gen CFTR. Los cebadores diseñados para estudiar los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) (reacciones de extensión de un único nucleótido), diferían en longitud mediante la adición en el extremo 5´ de colas de poly (dT). Las temperaturas de anillamiento de los cebadores fueron similares, con el fin de permitir el análisis mediante multiplex. Los cebadores fueron diseñados mediante el programa Primer Express.
Para el análisis de las 11 mutaciones seleccionadas se diseñaron dos multiplex: el multiplex 1 (M1) analiza los polimorfismos K710X, R1066C/R1066S, 2869 insG y Q890X; en tanto que el multiplex 2 (M2) analiza los polimorfismos L206W, 1609delCA, R1066L/R1066H, R709X y 1811+1.6 Kb.
Los productos fluorescentes obtenidos como consecuencia de las amplificaciones por PCR fueron analizados en un analizador genético ABI Prism 310 o ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems).
La movilidad de los oligonucleótidos sometidos a electroforesis capilar fué determinada basándonos en tamaño, composición nucleotídica y fluoróforos. Dado que los oligonucleótidos utilizados eran de diferente tamaño, los productos analizados mostraron electroforesis específicas para cada mutación. Los electroforegramas de muestras heterocigotas mostraron dos picos (de diferente color según la base incorporada), mientras que las muestras homocigotas mostraron un solo pico de color distinto según el alelo (salvaje o mutado).
El análisis en multiplex presentado aquí junto con el análisis de FQ comercializado por Applied Biosystems –el cual posibilita analizar 31 mutaciones– permitiría incrementar la tasa de detección de mutaciones en España y en regiones mediterráneas hasta ~80%.

María Esther Fárez Vidal *

Referencias bibliográficas

Farrell PM. Adv Pediatr 2000; 47:79-115.
Waters DL, Wilcken B, Irwing L, Van Asperen P, Mellis C, Simpson JM et al. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 1999;80:F1-F7.
Merelle ME, Schouten JP, Gerritsen J, Dankert-Roelse JE. Eur Respir J 2001;18:306-15.
Bobadilla JL, Macek M, Fine JP, Farrell PM. Hum Mutat 2002;19:576-606.
Estivill X, Bancells C, Ramos C. Hum Mutat 1997;10:135-54.
Casals T, Ramos MD, Gimenez J, Larriba S, Nunes V, Estivill X. Hum Genet 1997;101:365-70.

Para comunicarse con María Esther Fárez Vidal mencionar a SIIC como referencia: 
Avda. Dr. Oloriz 16, 18012, Granada, Granada, España
Fono: 58 23107; Fax: 58 249015
efarez@ugr.es

MULTIMUTATIONAL ANALYSIS OF ELEVEN CYSTIC FIBROSIS MUTATIONS COMMON IN THE MEDITERRANEAN AREAS

Título en castellano
ANALISIS MULTIMUTACIONAL DE ONCE MUTACIONES DE FIBROSIS QUISTICA COMUNES EN LAS AREAS MEDITERRANEAS

Autores
María Esther Fárez Vidal,¹ Carolina Gómez Llorente,² Sonia Blanco,³ Pablo Morales,⁴ Teresa Casals,⁵ José Antonio Gómez Capilla⁶

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