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OLIGOMERIZACION DE CRY1AB DE Bacillus thuringiensis INCREMENTA UNION A AMINOPEPTIDASA E INSERCION EN MEMBRANA

El mecanismo de acción de las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis involucra la participación secuencial de receptores. La toxina en forma monomérica interactúa con el receptor caderina, esto induce un cambio conformacional y corte de hélice alfa-1. Se exponen sitios hidrofóbicos y provoca oligomerización. El oligómero incrementa la afinidad por receptor-aminopeptidasa. Este receptor induce inserción de toxina en microdominios de membrana.

* Alejandra Bravo
describe para SIIC los aspectos relevantes de su trabajo
OLIGOMERIZATION TRIGGERS BINDING OF A Bacillus thuringiensis CRY1 AB PORE-FORMING TOXIN TO AMINOPEPTIDASE N RECEPTOR LEADING TO INSERTION INTO MEMBRANE MICRODOMAINS,
recientemente editado en
Biochimca et Biophysica Acta,
1667:38-46, 2004

Institución principal de la investigación
* Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México., Cuernavaca, México

Cuernavaca, México (especial para SIIC):
Las toxinas Cry1A de Bacillus thuringiensis se unen a dos receptores en membranas de insectos blanco, identificados como aminopeptidasa N (APN) y una proteína semejante a la caderina.¹ En este trabajo mostramos que la unión de la toxina Cry1Ab a los dos receptores es secuencial; primero se une a la caderina y luego a la APN, y comprobamos que esta unión secuencial depende del estado oligomérico de la toxina. La toxina en forma monomérica se une al receptor caderina ya que tiene una afinidad 100 veces mayor hacia la caderina respecto de la APN.^2,3 Esta unión induce un corte proteolítico de la toxina donde se elimina la hélice-alfa-1. La pérdida de esta hélice expone regiones hidrofóbicas internas induciendo la formación de un oligómero, probablemente un tetrámero.⁴ La estructura oligomérica de la toxina incrementa 200 veces su afinidad por un segundo receptor APN. La APN dirige el oligómero a microdominios de membrana, los cuales presentan una estructura más ordenada que el resto de los lípidos y están involucrados en la señalización intracelular.⁵ Es en estas membranas donde se inserta la toxina para formar el poro. Para comprobar el papel de la APN en dirigir la toxina a los microdominios de membrana eliminamos la APN por medio de un tratamiento con fosfolipasa-C, ya que la APN está anclada a la membrana por medio de un puente glucosil-fosfatidil-inocitol, que es susceptible al corte con fosfolipasa-C.⁶ El corte de APN previene que la toxina se localice en los microdominios de membrana y se inserte en la membrana. Esto fue sorprendente ya que el receptor-caderina sigue estando presente, por lo que concluimos que la toxina en forma de oligómero no está interactuando con este receptor. Para comprobar la interacción de las formas oligoméricas y monoméricas de la toxina con ambos receptores realizamos experimentos de inmunoprecipitación. Estos experimentos nos permiten concluir que la toxina primero inteactúa con la caderina y luego con la APN. También que la forma monomérica interactúa mejor con la caderina, lo cual se explica por la diferencia en afinidad del monómero de la toxina hacia ambos receptores (1nM para caderina y 100 nM para APN). En cambio, la forma oligomérica interactúa mejor con la APN que con la caderina, y logramos medir la afinidad de la interacción APN-oligómero (afinidad de 0.7 nM) que se incrementa casi 200 veces respecto de la afinidad que tenía el monómero por la APN. Nuestros datos nos permiten proponer que los dos receptores son importantes en la intoxicación con toxinas Cry y en la muerte de los insectos, presentando diferentes funciones. El receptor-caderina está involucrado en la correcta activación de la toxina para poder formar el oligómero y el receptor-APN está involucrado en llevar este oligómero a los microdominios de membrana y ayudar en la inserción en membrana, lo cual resultará en la formación del poro que matará las células del intestino del insecto. Este conocimiento puede ser relevante en el desarrollo de resistencia a estas toxinas, ya que mutaciones en cualquiera de los receptores resultarán en insectos resistentes.

Alejandra Bravo *
Referencias bibliográficas
1. Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler DR, Dean DH. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1998):775-806. 2. Sangadala S, Walters FW, English LH, Adang MJ. A mixture of Manduca sexta aminopeptidase and phosphatase enhances Bacillus thuringiensis insecticidal CryIA(c) toxin binding and 86Rb+-K+ efflux in vitro, J. Biol. Chem. 269 (1994) 10088-10092. 3. Vadlamudi RK, Ji TH, Bulla LA Jr-. A specific binding protein from Manduca sexta for the insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis subsp. berliner, J. Biol. Chem. 268 (1993) 12334-12340. 4. Gómez I, Sánchez J, Miranda R, Bravo A, Soberón A. Cadherin-like receptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix a-1 in domain I and oligomer pre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin, FEBS Lett. 513 (2002) 242-246. 5. Knight P, Crickmore N, Ellar DJ. The receptor for Bacillus thuringiensis CryIA(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the lepidopteran Manduca sexta is aminopeptidase, Mol. Microbiol. 11 (1994) 429-436.

Otros artículos de Alejandra Bravo Zhuang M, Oltean DI, Gómez I, Pullikuth AK, Soberon M, Bravo A, Gill SS. 2002 Heliothis virescens and Manduca sexta lipid rafts are involved in Cry1A toxin binding to the midgut epithelium and subsequent pore formation. J Biol Chem. 277:13863-13872. Bravo J, Sánchez T, Kouskoura, Crickmore N. 2002. N-terminal activation is an essential early step in the mechanism of action of the B. thuringiensis Cry1Ac insecticidal toxin J. Biol. Chem. 277(27):23985-7. Gómez I, Miranda Ríos J, Rudiño Piñera E, Oltean DI, Gill SS, Bravo A, Soberón M. 2002. Hydropathic complementarity determines interaction of epitope 869HITDTNNK876 in Manduca sexta Bt-R1 receptor with loop 2 of domain II of Bacillus thuringiensis Cry1A toxins. J. Biol. Chem 277:30137-30143. De Maagd RA, Bravo A, Berry C, Crickmore N, Schnepf HE. 2003. Structure, diversity and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann. Rev. Genet. 37:409-433. Gómez I, Dean DH, Bravo A, Soberón M. 2003 Molecular basis for Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin specificity: Two structural determinants in the Manduca sexta Bt-R1 receptor interact with loops a-8 and 2 in domain II of Cy1Ab toxin. Biochemistry. 42:10482-10489. Ibarra JE, Del Rincón MC, Ordúz S, Noriega D, Benintende G, Monnerat R, Regis L, De Oliveira CMF, Sánchez J, Bravo A. 2003. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity against different mosquitoes species. Appl. Environm Microbiol. 69:5269-5274. Rausell C, García Robles I, Sánchez J, Muñoz Garay C, Martínez Ramírez AC, Real MD, Bravo A. 2004. Role of toxin activation on binding and pore formation activity of the Bacillus thuringiensis Cry3 toxins in membranes of Leptinotarsa decemlineata [Say]. Biochem. Biophys Acta. 1660:99-105. Rausell C, Muñoz Garay C, Miranda CassoLuengo R, Gómez I, Rudiño Piñera E, Soberón M, Bravo A. 2004. Tryptophan spectroscopy studies and black lipid bilayer analysis indicate that the oligomeric structure of Cry1Ab toxin from Bacillus thuringiensis is the membrane-insertion intermediate. Biochemistry. 43:166-174. Rausell C, Pardo López L, Sánchez J, Muñoz Garay C, Morera C, Soberón M, Bravo A. 2004. Unfolding events in the water-soluble monomeric Cry1Ab toxin during transition to oligomeric pre-pore and membrane inserted pore channel. J. Biol. Chem 279:55168-55175. Xie R, Zhuang M, Ross LS, Gómez I, Oltean DI, Bravo A, Soberón M, Gill SS. 2005. Single amino acid mutations in the cadherin receptor from Heliothis virescens affect its toxin binding ability to Cry1A toxins. J Biol Chem. 280:8416-8425.

Para comunicarse con Alejandra Bravo mencionar a SIIC como referencia: Ap Postal 510-3, 62250, Cuernavaca, Morelos, México Fono: 777 3291635; Fax: 777 3291624 bravo@ibt.unam.mx

Título en castellano
LA OLIGOMERIZACION DE LA TOXINA FORMADORA DE PORO CRY1AB DE Bacillus thuringiensis INDUCE LA UNION AL RECEPTOR AMINOPEPTIDASA N, EL CUAL DIRIGE LA INSERCION EN MICRODOMINIOS DE MEMBRANA

Autores
Alejandra Bravo,¹ Isabel Gómez,² Juan Conde,³ Carlos Muñoz Garay,⁴ Jorge Sánchez,⁵ Meibao Zhuang,⁶ Sarjeet Gill,⁷ Mario Soberón⁸

1 Dr. en Investigación Biomédica, Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México. Investigador Titular C
2 Dr. en Ciencias Bioquímicas, Instituto de Biotecnología Unam, Investigador Asociado C
3 Estudiante Maestría Ciencias B, Instituto de Biotecnología Unam, Estudiante
4 Investigador Asociado C, Instituto de Biotecnología Unam, Investigador Asociado C
5 Biólogo, Instituto de Biotecnología Unam, Técnico Académico
6 Dr. en Bioquímica, University of California Riverside, Estudiante Doctorado
7 Dr. en Entomologia, University of California Riverside, Professor
8 Dr. en Investigacion Biomédica, Instituto de Biotecnología Unam, Investigador Titular C