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PARTICIPACION DE LA PROTEASA EhCP112 EN LA VIRULENCIA DE Entamoeba histolytica

* Mario Rodríguez
describe para SIIC los aspectos relevantes de su trabajo
EhCP112 IS AN Entamoeba histolytica SECRETED CYSTEINE PROTEASE THAT MAY BE INVOLVED IN THE PARASITE-VIRULENCE,
recientemente editado en
Cellular Microbiology,
7(2)221-232, 2005

Institución principal de la investigación
* Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, México, DF, México

México, DF, México (especial para SIIC):
La citopatogenicidad de Entamoeba histolytica se divide en tres eventos: adhesión, citólisis y fagocitosis. La identificación y caracterización de las moléculas que participan en estos eventos es de vital importancia para entender los mecanismos moleculares que desarrolla el parásito para dañar al huésped y, entonces, diseñar nuevas estrategias de control contra la amibiasis. Una de estas moléculas es el complejo EhCPADH, el cual está compuesto por dos polipéptidos, una cisteína proteasa (EhCP112) y una adhesina (EhADH112). Trabajos anteriores mostraron que EhADH112 es una molécula que utiliza E. histolytica para adherirse a las células blanco y que puede ser un candidato para el desarrollo de una vacuna contra la amibiasis. En este trabajo caracterizamos las propiedades biológicas del péptido EhCP112. Para ello utilizamos la expresión del polipéptido en bacterias Escherichia coli, determinamos la localización subcelular de la proteína nativa y analizamos su expresión en mutantes deficientes en virulencia. Inicialmente clonamos en los vectores de expresión pRSET y ptrCHis (Invitrogen) tres diferentes fragmentos del gen Ehcp112: i) el gen completo que codifica un péptido señal, un propéptido que tiene que ser procesado proteolíticamente para que la enzima sea activa y la enzima madura; ii) un fragmento del gen que codifica el propétido y la enzima madura; y iii) el fragmento que codifica solamente la enzima madura. Las dos primeras construcciones fueron expresadas en las bacterias, mientras que la tercera, probablemente por su toxicidad para las bacterias, no pudo ser expresada. Al determinar la actividad proteolítica de las proteínas recombinantes en geles de sustrato, encontramos que sólo el péptido generado por la segunda construcción tuvo actividad. Esta proteína recombinante (rEhCP112) tuvo fuerte actividad proteolítica contra azocaseína y gelatina. La purificación de la proteína recombinnate permitió entonces su caracterización bioquímica. Esta caracterización mostró que: i) rEhCP112 tiene actividad contra células epiteliales y contra sustratos encontrados en el tejido del huésped, como fibronectina, colágena tipo I y hemoglobina; y ii) la actividad de EhCP112 se conserva en un amplio rango de temperatura y de pH, lo cual sugiere que pude estar activa en diferentes tejidos del huésped. Para localizar subcelularmente la proteína nativa, se generaron anticuerpos contra la proteína recombinante, estos anticuerpos identificaron la proteína nativa en la membrana de los trofozoítos amibianos. Además, nuestros experimentos indicaron que el complejo EhCPADH también es secretado al medio de cultivo. Por otra parte, encontramos que una mutante deficiente en la producción de abscesos hepáticos en animales de experimentación expresa pobremente el complejo EhCP112, en comparación con los trofozoítos muy virulentos. Todos estos resultados sugieren que EhCP112 puede ser una enzima con participación activa en la patogenicidad de E. histolytica.

Mario Rodríguez *
Referencias bibliográficas
1. Banuelos C, García Rivera G, López Reyes I, Orozco E. Functional characterization of EhADH112: An Entamoeba histolytica Bro1 domain-containing protein. Exp Parasitol. 2005 110(3):292-297. 2. Guzmán Medrano R, Castillo Juárez BA, García Pérez RM, Salas Casas A, Orozco E, Rodríguez MA. Entamoeba histolytica: Alterations in EhRabB protein in a phagocytosis deficient mutant correlate with the Entamoeba dispar RabB sequence. Exp Parasitol. 2005 110(3):259-264.

Otros artículos de Mario Rodríguez Rodríguez MA, Orozco E. 1986. Isolation and characterization of phagocytosis- and virulence- deficient mutants of Entamoeba histolytica. J Infect Dis 154: 27-32. Rodríguez MA, Hernández F, Santos L, Valdez A, Orozco E. 1989. Entamoeba histolytica: molecules involved in the target cell-parasite relationship. Mol Biochem Parasitol 37:87-99. García Rivera G, Rodríguez MA, Ocádiz R, Martínez López MC, Arroyo R, González Robles A, Orozco E. 1999. Entamoeba histolytica: a novel cysteine protease an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol 33:556-568. Martínez López C, Orozco E, Sánchez T, García Pérez RM, Hernández Hernández F, Rodríguez MA. 2004. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscesses formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol 6:367-376. Madriz X, Martínez MB, Rodríguez MA, Sierra G, Martínez López C, Riverón AM, Flores L, Orozco E. 2004. Expression in fibroblast and in live animals of Entamoeba histolytica EhCP112 and EhADH112 polypeptides. Microbiology 150:1251-1260. Rodríguez MA, Hidalgo ME, Sánchez T, Orozco E. 1996. Cloning and characterization of the Entamoeba histolytica pyruvate: ferredoxin oxidoreductase gene. Mol Biochem Parasitol. 78:273-277. Rodríguez MA, García Pérez RM, Sánchez T, Guillen N, Mendoza L, Orozco E. 1998. The pyruvate:ferredoxin oxidoreductase is located in the plasma membrane and in a cytoplasmic structure in Entamoeba. Microb Path 25:1-10. Rodríguez MA, García Pérez RM, García Rivera G, López Reyes I, Mendoza L, Ortiz Navarrete V, Orozco E. 2000. An Entamoeba histolytica Rab-like encoding gene and protein: Function and cellular location. Mol Biochem Parasitol 108:199-206. Picazarri K, Luna Arias JP, Carrillo E, Orozco E, Rodríguez MA. 2005. Entamoeba histolytica: Identification of EhGPCR-1, a novel putative G protein-coupled receptor that binds to EhRabB. Exp Parasitol 110:253-258. Guzmán Medrano R, Castillo Juárez BA, García Pérez RM, Salas Casas A, Orozco E, Rodríguez MA. 2005. Entamoeba histolytica: alterations in EhRabB protein in a phagocytosis deficient mutant correlate with the Entamoeba dispar RabB sequence. Exp Parasitol 110:259-264.

Para comunicarse con Mario Rodríguez mencionar a SIIC como referencia: A.P. 14-740, 0700, México, DF , México Fono: 55 50613800; Fax: 55 50613800 marodri@cinvestav.mx

Título en castellano
EhCP112 ES UNA CISTEIMNA PROTEASA SECRETADA DE Entamoeba histolytica QUE PUEDE ESTAR INVOLUCRADA EN LA VIRULENCIA DEL PARASITO

Autores
Mario Rodríguez,¹ Ramón Ocádiz,² Esther Orozco,³,Laura Quintas,⁴ Jaime Ortega López,⁵ Eduardo Carrillo,⁶ Rosa García,⁷ Tomás Sánchez,⁸ Beatriz Castillo Juárez⁹

1 Dr. en Ciencias, Cinvestav-IPN, Profesor-investigador
2 Maestro en Ciencias, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía del IPN, Estudiante
3 Dr. en Ciencias, Cinvestav-IPN, Profesor-investigador
4 Meastro en Ciencias, Cinvestav-IPN, Estudiante
5 Dr. en Ciencias, Cinvestav-IPN, Profesor Investigador
6 Biólogo, Cinvestav-IPN, Estudiante
7 Química Farmacobióloga, Cinvestav-IPN, Auxiliar de Investigación
8 Químico Biólogo Parasitólogo, Cinvestav-IPN, Auxiliar de Investigación
9 Biólogo, Cinvestav-IPN, Estudiante