PEPTONA PAPAÍNICA DE CORAZÓN DE VACA COMO FUENTE DE NUTRIENTES PARA LOS MICROORGANISMOS

Artículo completo
Introducción

Las peptonas y los extractos proteicos son excelentes fuentes naturales de aminoácidos, péptidos y proteínas para el cultivo de los microorganismos.¹ El número de estos productos disponibles en el mercado es significativo. Ellos se obtienen, tradicionalmente, por la digestión enzimática o hidrólisis ácida de sustratos naturales de origen proteico, tales como carne de vaca, leche, caseína, gelatina, plantas o biomasa de microorganismos.^2-4Estos sustratos son proteínas de alto valor nutritivo, todas comprometidas con la alimentación humana.⁵ Por esta razón, varios autores realizan numerosos intentos de obtener peptonas a partir de fuentes de proteínas no tradicionales y subproductos, utilizando para ello los residuos de la industria pesquera,⁶ subproductos de la industria cárnica,^4,7microalgas,⁸ entre otros.⁹ En la actualidad existen informes sobre la utilización de tejidos animales, procedentes de porcinos y equinos, o la combinación de ambos.^10,11El corazón de vaca es un subproducto de la industria cárnica y su valor nutritivo es menor que el de la carne. La presencia de grasa, tejido conectivo y vascular lo hacen menos atractivo para la producción de peptona y resulta en un desafío tecnológico obtener un producto de alta calidad que promueva el crecimiento microbiano de manera similar a la peptona de carne de vaca, usualmente conocida como peptona bacteriológica.
Varios autores han desarrollado métodos para la obtención de los digeridos del músculo de corazón animal como ingredientes de medios de cultivo para los microorganismos.^12,13 Para esto, es necesaria la comparación del comportamiento de la base nutritiva obtenida con peptonas estándar ya evaluadas previamente.

El objetivo de la presente investigación consistió en el desarrollo de un método de obtención de la peptona papaínica de corazón de vaca y la comparación de su capacidad de promoción de crecimiento microbiano con las peptonas comúnmente empleadas en microbiología.

Materiales y métodos
Materiales

Se utilizó corazón de vaca recolectado en el matadero “Antonio Maceo” de la Ciudad de La Habana, transportado en vehículos refrigerados a temperatura de 2 a 8°C y almacenado a temperatura de -20 °C por un período hasta 3 meses.

Hidrólisis de corazón de vaca

El corazón se sometió a un proceso de limpieza manual, eliminando los tejidos grasos, conectivos y vasculares. El tejido del músculo de corazón de vaca, se molió a través de una rejilla con el diámetro de orificio de 3 mm. El picadillo obtenido se mezcló con agua desionizada. Para la hidrólisis se empleó la enzima papaína de 700 TU (Biocatalysts, Reino Unido). Para el ajuste del pH se utilizó ácido clorhídrico al 37% (Merck, Alemania), diluido 1:1, e hidróxido de sodio (Panreac, España), en solución al 40% (p/p). Se realizó el tratamiento térmico consistente en hervir la mezcla por 30 minutos. Se filtró por placa clarificante al vacío, se concentró en un rotoevaporador (IKA-Labortechnik, Alemania) y se deshidrató por aspersión en un secador piloto (Niro Atomizer, Dinamarca) para la obtención de la peptona papaínica de corazón de vaca (PPCV).
Se estudió la influencia del pH de hidrólisis y de la cantidad de la enzima papaína sobre la calidad de la PPCV, obtenida mediante un diseño experimental completamente aleatorizado, según un plan factorial 2² (Tabla 1), ejecutando cada determinación para las variables a analizar por triplicado (n = 3).¹⁴Los niveles de papaína a utilizar se determinaron previamente por los autores, según las experiencias preliminares.⁵Como variables a analizar se seleccionaron los contenidos de nitrógeno amínico (Nam), nitrógeno total (Nt), cloruros (en forma de NaCl) (NaCl) y la relación entre nitrógeno amínico y nitrógeno total (Nam/Nt). Se estudió la composición química de PPCV y su capacidad de promoción del crecimiento para varios microorganismos.

Métodos analíticos

El contenido de Nam se determinó por el método potenciométrico (PHM 83 Autocal, Radiometer, Dinamarca) en presencia de formaldehído.^15,16Los valores deNt se establecieron por el método de Kjeldahl, con la ayuda del sistema automático Kjeltec System Tecator (Suecia).¹⁷La relación Nam/Nt total se expresó en porcentaje. El contenido de NaCl se halló por el método de Volhard.¹⁸ La pérdida por desecación (PD) se determinó por el método gravimétrico, secando la muestra a 105°C hasta peso constante.¹⁵ Para la cuantificación de los aminoácidos, la muestra de PPCV fue sometida a hidrólisis ácida con una solución de ácido clorhídrico 6 N, según Davies y Thomas,¹⁹ durante 24 h a 105°C, filtrada y conservada en buffer con pH 2.2 hasta su aplicación en un analizador de aminoácidos, modelo Alpha Plus (Pharmacia, Suecia). El contenido de triptófano libre se determinó por el método colorimétrico¹⁸ con la ayuda de un espectrofotómetro (PU 8620, PHILIPS, Reino Unido).
La determinación de calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro, sodio, potasio, cobalto y plomo se realizó en un espectrofotómetro de absorción atómica SP9 de la Pye Unicam Ltd. (Reino Unido).^20-24

Microorganismos y medios de cultivo

La determinación de la densidad óptica de los cultivos microbianos en el tiempo, para un grupo de cepas microbianas de colección (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Bacillus subtilis ATCC 6633) se realizó en un medio especialmente diseñado al efecto²⁵ que contenía 2% de PPCV; 0.5% NaCl y 0.1% de Na₂HPO₄; pH 7.0-7.2. Los valores de la densidad óptica de los cultivos a 37°C se registraron cada una hora durante 8 horas. Los cultivos de B. subtilis se incubaron a 30°C. Los valores se compararon con los obtenidos en un medio formulado con la peptona bacteriológica tomada como referencia (Biotécnica Internacional, México) (PBBI).
Se estudió el desempeño de la PPCV, en comparación con PBBI, y con peptona bacteriológica de Marine Chemicals, India (PBMC), en agar dextrosa de Sabouraud²⁶ frente a varios microorganismos de la ATCC: Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans ATCC 17111, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y Saccharomyces uvarum ATCC 9080, por el método de siembra por vertimiento en placa.²⁷
Para la preparación de los inóculos se utilizaron cultivos frescos de 18-24 h de los microorganismos de referencia en agar triptona soja.²⁶ Las suspensiones microbianas en solución salina estéril al 0.85% (p/v) (NaCl, grado analítico; Merck, Alemania) se homogeneizaron en el agitador de tubos (VF2, IKA-Labortechnik, Alemania). La concentración de células microbianas (aproximadamente a 3.0 x 10⁸ células/ml) se ajustó al 50% de transmitancia a 580 nm (espectrofotómetro PU 8620, Philips, Pye Unicam Ltd., Reino Unido). Las diluciones decimales se prepararon según establece la norma ISO 6887-1.²⁸

Medición del crecimiento

Se determinó la densidad microbiana en el tiempo estudiando el incremento de la absorbancia a 640 nm (espectrofotómetro PU 8620, PHIlIPS, Pye Unicam Ltd., Reino Unido). Los recuentos de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) se realizaron con ayuda de un contador de colonias (Gallenkamp, Reino Unido).

Tratamiento estadístico

Se calculó la desviación estándar de todos los valores de los parámetros químicos. Con los resultados obtenidos en el diseño experimental 2² se procedió a adaptar el siguiente polinomio:

y = b₀ + b₁x₁ + b₂x₂ + b₁₂x₁x_{_2,}

según López Planes.¹⁴ Los coeficientes "b_n" se calcularon mediante el sistema matricial B = (X’X)^-1X’Y, donde: Y = matriz de los resultados experimentales; X = matriz de las variables independientes. Su significación para p < 0.5 se determinó mediante la prueba de Student. La adecuación del modelo se detectó mediante la prueba de Fisher. En los casos requeridos se empleó la prueba de rangos múltiples de Duncan (p < 0.05). Para todo el tratamiento estadístico se utilizó el paquete estadístico “Statistica6”, de StatSoft, Inc. (EE.UU.).

Resultados

El procesamiento estadístico de los datos experimentales obtenidos en el diseño factorial 2²ofreció los modelos siguientes para el Nam, Nt, Nam/Nt y NaCl, respectivamente, todos expresados en porcentaje:
y = 2,75 – 0,27x₁ + 0,03x₂- 0,03x₁x₂y = 12,93 + 0,18x₁y = 21,27 – 2,36x₁y = 5,59 + 0,40x₂Al observar los resultados presentados en la Figura 1, juntamente con las ecuaciones de regresión obtenidas, se pudo concluir que el pH (x₁) es la variable que ejerce la mayor influencia (inversamente proporcional) sobre el contenido de Nam (Figura 1a) y, seguidamente, influyó la cantidad de enzima papaína de 700 TU de actividad utilizada (x₂). Se detectó que el Nam aumentó más en las variantes realizadas con 0.86 g de enzima por un kilogramo de sustrato. La interacción de ambas variables favoreció el incremento de Nam al emplear el valor mínimo de pH 5 y el valor máximo de enzima 0.86 g/kg. Estos resultados correspondieron a la variante tres, con la cual se logró el valor de Nam de 3.07 ± 0.05% y se obtuvo una diferencia significativa para p < 0.05 de esta variante con respecto a las tres restantes.

Figura 1

La variante uno también arrojó diferencia significativa para p < 0.05, en comparación con las tres variantes estudiadas en el diseño y el Nam alcanzó valores de 2.96 ± 0.03%. El contenido de Nam en las variantes dos y cuatro resultó 2.47 ± 0.02% y 2.48 ± 0.02%, respectivamente, para las cuales no se detectó diferencia significativa para p < 0.05.

Los valores de Nt (Figura 1b) se comportaron de manera similar para las variantes uno, dos y tres (12.71 ± 0.24%; 13.01 ± 0.12% y 12.80 ± 0.06%, respectivamente), sin existir diferencia significativa (p < 0.05) entre los mismos. Sin embargo, sí se obtuvo diferencia significativa (p < 0.05) para el contenido de Nt en la variante cuatro (13.20 ± 0.21%), en comparación con las tres primeras. La ecuación de regresión para el Nt mostró la mayor influencia de la variable x₁con su nivel superior (pH 6.5) sobre el contenido de Nt en el producto final.
La relación Nam/Nt (Figura 1c) alcanzó su mayor nivel para la variante tres del diseño (23.95 ± 0.46%) y resultó significativamente diferente (p < 0.05) con respecto a los valores de este índice, logrados con las variantes dos (19.03 ± 0.20%) y cuatro (18.79 ± 0.36%). En comparación con la variante uno no se observaron diferencias significativas para p < 0.05. La ecuación de regresión mostró la influencia significativa de la variable pH sobre el indicador estudiado, logrando mejores resultados con su nivel bajo, a pH 5.

En cuanto al contenido de NaCl (Figura 1d), los valores 5.33 ± 0.46%; 5.04 ± 0.51%; 6.13 ± 0.24% y 5.84 ± 0.34%, corresponden a las variantes uno, dos, tres y cuatro, respectivamente. La variante tres resultó significativamente diferente (p < 0.05) de las variantes uno y dos (valores menores), no así con respecto a la variante cuatro.
En las Tablas 2 y 3 se brindan las composiciones química y aminoacídica de PPCV, respectivamente.

La nueva peptona mostró un valor reducido de pérdida por desecación (3.17 g/100 g), y el nitrógeno amínico constituye alrededor del 25% del nitrógeno total. Todos los minerales que caracterizan las peptonas están presentes en concentraciones de 0.36 a 3.13 g/100 g, en el caso de los macroelementos, y de 0.4 a 356 ppm en el caso de los microelementos. La excepción es el plomo, cuya concentración es menor de 0.1 ppm.
Todos los aminoácidos están presentes en el producto y su contenido osciló entre 0.75 y 7.15 g/100 g.

Figura 2

En la Figura 2 se observan los resultados del desempeño de la PPCV, en comparación con la PBBI, al estudiar la densidad microbiana en el tiempo. Para S. aureus (Figura 2a) se obtuvo una diferencia significativa para p < 0.05 a partir de la tercera hora de incubación. Para S. typhimurium (Figura 2b), E. faecalis (Figura 2c), E. faecium (Figura 2d) y P. aeruginosa (Figura 2e), la diferencia detectada fue significativamente superior (p < 0.05), a partir de la segunda hora de incubación, para la PPCV, en comparación con el control utilizado. El crecimiento de B. cereus (Figura 2f) se comportó de manera similar para la PPCV y PBBI.

La Figura 3 muestra la funcionalidad del agar dextrosa de Sabouraud, preparado con PPCV, PBBI y PBMC. El recuento de UFC para C. albicans en el medio agar dextrosa de Sabouraud, preparado con PPCV, resultó significativamente superior (para p < 0.05) al obtenido en el medio elaborado con la PBBI. Por otra parte, no hubo diferencia significativa para p < 0.05 en los recuentos de C. albicans 10231 en los medios con la inclusión de PPCV y PBMC. Respecto de los recuentos de C. albicans 17111 y S. uvarum 9080, no se detectaron diferencias significativas (p < 0.05) en las tres variantes estudiadas. Los recuentos de S. cerevisiae 9763 en el medio experimental con PPCV fueron significativamente superiores (para p < 0.05) en comparación con el medio similar elaborado con la PBMC, no así al compararlos con los del medio de la misma composición preparado con la PBBI.

Discusión

El hallazgo de que el valor del pH es la variable que influye de manera más significativa sobre el grado de hidrólisis en la producción de peptonas coincide con resultados anteriores divulgados por los autores¹³y por otros investigadores.²⁹
El valor más elevado del pH estudiado influyó en el aumento de la solubilidad de las proteínas del tejido del músculo de corazón de vaca al alejarse del punto isoeléctrico de la mayoría de ellas.³⁰ Este planteamiento se corroboró con la ecuación de regresión para el nitrógeno total, donde se puso de manifiesto la influencia de la variable x₁con su nivel superior, elevando el valor de Nt al máximo.
A manera de resumen, se puede afirmar que la mejor variante de este diseño resultó ser la número tres, corroborando, de esta forma, la conveniencia de realizar la hidrólisis a pH 5.

Los valores de PD para PPCV se encontraron por debajo del 6%, coincidiendo con los valores informados para los digeridos enzimáticos de corazón deshidratados 2.8%-6% que, a su vez, coinciden con los establecidos para las peptonas bacteriológicas 3.0%-6.0%.^11,31-35 Estos hallazgos concuerdan con los informes de Mourey Valdés y col.,³⁶ quienes plantean que para los países con el clima tropical, el límite de este indicador se encuentra normalmente en valores iguales o inferiores al 8%. Los niveles alcanzados para este indicador garantizan la mayor estabilidad del producto durante la conservación, al impedir las interacciones químicas.
Los hidrolizados de proteínas se caracterizan por diferentes niveles de Nam. Sus valores varían desde el 1% para peptona de gelatina³¹ hasta el 7.6% para la peptona de carne.³⁷ El contenido de Nam en PPCV coincide con los informes existentes para otras peptonas de corazón 2.8%-5.6%.^11,31-35 El valor señalado para PPCV se asemeja de manera más relevante a los valores comunicados por la empresa Organotechnie (Francia) (2.0%-4.0%) para el extracto de corazón obtenido por vía de hidrólisis enzimática con papaína.³³El valor de Nt para la mejor variante de PPCV, seleccionada por el conjunto de los indicadores, se enmarcó entre 9.8% y 13.1%, valores comunicados por diferentes empresas productoras de bases nutritivas, mencionadas anteriormente. El contenido de Nt en los prototipos más cercanos a PPCV varía entre 12.5% y 14.0%.^11,33
La relación Nam/Nt para PPCV se ubicó en los rangos informados por diferentes fabricantes de los digeridos pancreáticos de corazón (17%-45%).^11,31-34El nivel de NaCl resultó coherente con el valor declarado para el extracto papaínico de corazón (6.5%).³³Este contenido de cloruro de sodio permite garantizar un adecuado nivel de iones al introducir PPCV en los medios de cultivo para los microorganismos.

El análisis del contenido de macroelementos y microelementos demostró que la peptona de corazón desarrollada tiene un elevado contenido de elementos tales como K, Ca y Fe, fundamentales para el crecimiento microbiano y que inciden en la formación del material genético, la síntesis de enzimas y de otros metabolitos fundamentales y los procesos de intercambio de la célula con el exterior.³⁸ Los resultados de este estudio concuerdan con los presentados por Biomérieux (Francia)³¹ para el digerido pancreático de corazón (bio-Myotone) mostrando los contenidos de 2% para K, 20 ppm para el Ca total, 160 ppm para el Fe. Coinciden, a su vez, con los informes existentes para estos elementos en las peptonas bacteriológicas y peptonas de carne: 1.4%-3.6% de K,^31,39 252-690 ppm de Ca total,^31,39 21-200 ppm de Fe.³⁹
El contenido de fosfatos, expresados como P₂O₅, en PPCV es bajo y, por lo tanto, resulta adecuado para el empleo en medios líquidos, debido a que no causa la precipitación de sus componentes. Es comparable también con los valores comunicados para el análogo más cercano: 0.63%,³¹y 0.8% y 1.1% para la peptona bacteriológica y la peptona de carne, respectivamente, ambas de Oxoid Ltd., Reino Unido.³⁹Los niveles de otros elementos, tales como Mg, Cu, Pb, Zn, Na y Co, resultaron satisfactorios y característicos de las peptonas en general: Mg 206-1 000 ppm, Cu 2-5 ppm, Zn 9.2-27 ppm, Co 0.1 ppm, comunicados por Oxoid,³⁹ para peptonas bacteriológica y de carne (Mg, Co, Pb, Zn y Co); por Biomérieux³¹ para peptona de carne y digerido pancreático de corazón (Mg), y por Solabia¹¹ para digerido enzimático de corazón (Mg).
El contenido de plomo inferior a 0.1 ppm beneficia al producto, ya que este elemento no es requerido para las células de bacterias y hongos para su metabolismo.⁴⁰El contenido de aminoácidos de la PPCV se asemeja a lo publicado en varios trabajos.^{11,31-33,35,39}Un grupo de aminoácidos de la peptona obtenida en la presente investigación superó el contenido de las peptonas de corazón referidas en la bibliografía. Entre ellos se destacan aminoácidos imprescindibles para el crecimiento de una amplia gama de microorganismos: cisteína, histidina, metionina, fenilalanina y tirosina. El contenido de otros aminoácidos, de suma importancia para la promoción de crecimiento, se asemeja o se encuentra en el rango característico de los productos obtenidos a partir de corazón, comercializados en la actualidad, entre ellos: alanina, glicina, lisina, prolina y triptófano. Aminoácidos tales como arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, isoleucina, leucina, serina, treonina y valina se encuentran en niveles inferiores a los informados en la revisión para los digeridos de corazón. Sin embargo, estos niveles son superiores, en algunos casos, o similares a los de otras peptonas bacteriológicas comercializadas a escala internacional y empleadas en los medios de cultivo con el mismo propósito. Sólo el contenido de valina es inferior al de los productos elaborados a partir de corazón similares que se encuentran en el mercado.

La diferencia en el contenido de aminoácidos, sin dudas, se debe, en mayor grado, a las diferencias en el método de obtención,⁴ ya que el nuevo método introducido en la producción es original y diferente en pasos claves del proceso hidrolítico y de purificación de los métodos anteriormente empleados. Haciendo un balance del contenido de aminoácidos, y teniendo en cuenta los resultados del crecimiento microbiano de los microorganismos ensayados en los medios formulados con la peptona de corazón en etapas anteriores, era de esperar que la PPCV, obtenida por el método desarrollado, promoviera adecuadamente el crecimiento de diferentes gérmenes microbianos.

Los resultados del presente estudio, relacionados con el aumento de la densidad microbiana en el tiempo, concuerdan con los presentados por otros autores, quienes informaron el excelente crecimiento para varios microorganismos en medios líquidos utilizando digerido enzimático de corazón de cerdo.¹¹Se puso de manifiesto la factibilidad de la utilización de PPCV en el cultivo y enumeración de mohos y levaduras al demostrar que la peptona obtenida en este estudio promueve el crecimiento de los microorganismos estudiados de manera “equivalente” (sin diferencia significativa o menor del 10%) a las empleadas en los medios controles (con PBBI y PBMC). Estos hallazgos coinciden con las investigaciones realizadas por otros autores que demuestran que la utilización de digerido enzimático de músculo de corazón favorece el crecimiento de diferentes microorganismos gramnegativos y grampositivos.⁴¹Se puede considerar la PPCV como una peptona bacteriológica, de acuerdo con la norma ISO/TS 11133-1:2000que establece los criteriospara la armonización de la descripción de varios componentes de medios de cultivo.⁴² Los índices de calidad y el desempeño de esta base nutritiva la ubican en el rango de productos considerados como peptonas; es apropiada, además, para el cultivo de bacterias y hongos en los medios de cultivo para diagnóstico clínico y sanitario.

Bibliografía del artículo
1. Zhurbenko R, Rodríguez Martínez C. Bases nutritivas para el cultivo de los microorganismos: Parte 1 – Procesos tecnológicos. Salud(i)Ciencia 16(4):420-5, 2008.
2. Guadix A, Guadix EM, Páez-Dueñas MP, González-Tello P, Camacho F. Procesos tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteínas. Ars Pharmaceutica 41(1):79-89, 2000.
3. Parrado J, Millan F, Hernández Pinzo I, Bautista J, Machado A. Characterization of enzymatic sunflower protein hydrolysates. J Agric Food Chem 41(11):1821-5, 1993.
4. Kurbanoglu EB, Kurbanoglu NI. A new process for the utilization as peptone of ram horn waste. J Biosci Bioeng 94(3):202-6, 2002.
5. Zhurbenko R. Metodología para el aprovechamiento de los subproductos de la industria alimenticia y otras proteínas en la evaluación de la calidad sanitaria de los alimentos [Tesis doctoral]. Universidad de La Habana, La Habana, 2005.
6. Martone CB, Pérez Borla O, Sánchez JJ. Fishery by-product as a nutrient source for bacteria and archaea growth media. Bioresour Technol 96(3):383-7, 2005.
7. Bhaskar N, Modi VK, Govindaraju K, Radha C, Lalitha RG. Utilization of meat industry by products: protein hydrolysate from sheep visceral mass. Bioresour Technol 98(2):388-94, 2007.
8. Morris HJ, Almarales A, Carrillo O, Bermúdez RC. Utilization of Chlorella vulgaris cell biomasa for the production of enzymatic protein hydrolysates. Bioresour Technol 99(16):7723-9, 2008.
9. Boucaud-Maitre Y, Carraz M, Cloppet H. Peptone bacteriologique obteniu par digestion papainique de residus de placenta humain. Ann Pharm Fr 39(1):65-76, 1981.
10. Meat peptones, Hydrolysates and Extract. Organotechnie. France. [Citado el 12 de agosto del 2009]. Disponible en: http://www.organotechnie.com.meatpept.htm.
11. Pork Heart Infusion – A1504. Solabia. France. [Citado el 12 de agosto del 2009]. Disponible en: http://www.solabia.fr/solabia/content/NT00004442.pdf.
12. Barnes EM. Bacterial growth on heart digest media in relation to the trypsin preparation used. [Citado el 12 de agosto del 2009]. Disponible en: http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/119888887/PDFSTART.
13. Rodríguez C, Zhurbenko R, Barroetabeña F, Varela A. Utilization of beef heart for the obtainment of peptone for bacteriology. Proceedings of the International Congress of Meat Science and Technology, Ago-Sep 27-1; La Habana, Cuba, 1990.
14. López Planes R. Diseño estadístico de experimentos. Coedición de la Universidad Autónoma de Yucatán y la Universidad de La Habana, pp. 1-50, 1994.
15. USP 27-NF-22. The United States Pharmacopeia. Twenty Seventh Revision. The National Formulary Twenty seventh edition en CD-ROM User Guide. Reagents. Pancreatic Digest of Casein [monografía en CD-ROM]. United Pharmacopoeial Convention, Inc. Rockville: Staff Liaison; 2004.
16. Morris Quevedo HJ, Almarales Arceo A, Romero Viamonte K, Vidal Colás M. Validación de un método potenciométrico para la determinación de nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de microalgas. Rev Cubana Farm 36(1):56-61, 2002.
17. Tecator. Determination of Kjeldahl nitrogen content with Kjeltec System 1026. Application Note, Sweden, 1987.
18. Runova VF, Bendas LG, Maksimova GA, Preobrazhenskaya EI, Raskin BM, Mielnikov VA. Mietodicheskie ukazania po primienieniyu fiziko-khimicheskikh mietodov kontrolia pitatielnikh sried. Moscú (URSS): Ministierstvo Zdravokhranienia SSSR, pp. 5-10, 1977.
19. Davies MG, Thomas AJ. An investigation of hydrolytic techniques for the amino acid analysis of foodstuffs. J Sci Food Agric 24:1525-40, 1973.
20. ISO 6490/1. International Standard. Animal feeding stuffs – Determination of magnesium content – Part 1: Atomic absorption spectrometric method. Geneva (Switzerland): ISO; 1985.
21. ISO 6490/2. International Standard. Animal feeding stuffs – Determination of calcium content – Part 2: Atomic absorption spectrometric method. Geneva (Switzerland): ISO; 1985.
22. Milner BA, Whiteside PJ. Introduction to atomic absorption spectrophotometry. scientific & analytical equipment. Philips. Third Edition. Pye Unicam Ltd., Reino Unido, pp. 38-9, 1984.
23. Standard Operating Procedure. No. 313. National Center For Toxicological Research Division of Chemistry, Analysis for Minerals in Animal Feed; 1994.
24. AOAC. Official Methods of Analysis. 16th Ed. Methode 27.1.54. Vol. II. Washington, D.C. (USA): Association of Official Analytical Chemists; 1995.
25. Sigma-Aldrich. Biochemiclas and Reagents for like Science Research. St. Louis: Sigma-Aldrich, p. 1534, 2000.
26. Rodríguez Martínez C, Zhurbenko R, Quesada Muñiz VJ, Lobaina Rodríguez T, Tsoraeva A, Díaz Pérez M, Durán Vila A, Varela Llanes AE. Manual de Medios de Cultivo. Tercera Edición. Habana (Cuba): ISBN 959-7160-25-0, BioCen, p. 265, 2004.
27. Sonnenwirth AC, Jarret L. Gradwohl métodos y diagnósticos del laboratorio clínico. Tomo 3. Habana (Cuba): Editorial Científico-Técnica, pp. 1233-7, 1983.
28. ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions. Geneva (Switzerland): ISO; 1999.
29. Camacho F, González-Tello P, Guadix EM. Influence of enzymes, ph and temperature on the kinetics of whey protein hydrolysis. Food Sci Techn Inter 4:79-84, 1998.
30. Constituents of the muscle fibers. Section from the book "Experimental Cookery From The Chemical And Physical Standpoint", by Belle Lowe. [Citado el 26 de agosto del 2009]. Disponible en: http://chestofbooks.com/food/science/Experimental-Cookery/Constituents-Of-The-Muscle-Fibers.html
31. bioMérieux. Bacteriology. France: bioMérieux; p. 13-5, 1983.
32. BBL. Manual of BBL products and laboratory procedures. USA: Becton Dickinson Microbiology Systems; 1988.
33. Organotechnie. Culture media constituentes. Ed. 1. France: La Courneuve; 1994.
34. Scharlau. Handbook of microbiological culture media. International Edition, 2000.
35. Constantino. Raw materials for the pharmaceutical industry. Torino (Italy): Società per L´Industria di Prodotti Biochimici; 1990.
36. Mourey Valdés L, Gurria Rafols M, Vidrio Sandre E, Bravo Brash J, Bañales MD. Manual de normas técnicas sanitarias de agentes de diagnóstico. Secretaría de Salud, Subsecretaría de regulación y fomento sanitario. México: Dirección General de Insumos para la Salud, 1990.
37. Panreac. Manual Básico de Microbiología. 3ra Edición. Cultimed, pp. II-1, III-1 – III-9, 2000.
38. Bridson, E. The development manufacture and control of microbiological culture media. Unipath Ltd., p. 181, 1994.
39. Oxoid. Manual. England: Unipath Limited, Basingstoke, Hampshire, RG24 OPW; pp. 277-91, 1995.
40. In vitro cultivation of micro-organisms. Butterworth-Heinemann Ltd. p. 28, 1992.
41. Columbia broth (7127). PI Rev NEW. [Citado el 12 de agosto del 2009]. Disponible en: http://www.jsunitech.com/product/culture/manual/Columbia%20Broth.pdf.
42. ISO/TS 11133-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. Geneva (Switzerland): ISO, 2000.