A AMEBÍASE DEVERIA DETECTAR-SE COM METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS MAIS ECONÓMICAS E ESPECÍFICAS

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Introdução

A (La) amebíase é uma (es una) infecção parasitária global causada pelo (por el) protozoário Entamoeba histolytica, possui (tiene) distribuição cosmopolita e representa um risco à saúde nos (un riesgo para la salud en los) países onde as (donde las) barreiras sanitárias são inadequadas.¹ Os (Los) indivíduos mais comumente acometidos são aqueles que possuem baixo (infectados son aquellos con bajo) poder aquisitivo, desnutrição e imunossupressão. Estima-se que 500 milhões de indivíduos em todo o mundo estejam (están) infectados pela (por) E. histolytica,² havendo entre 40 000 a 100 000 óbitos anuais (muertes anuales),³ o que coloca a amebíase como a segunda causa de morte dentre as doenças (muerte entre las enfermedades) parasitárias.⁴

Após a infecção do (Luego de la infección del) hospedeiro via ingestão de cistos, os trofozoítos colonizam o lúmen (la luz) intestinal onde multiplicam-se e vivem como comensais, usando bactérias e restos celulares como fontes de energia. Entretanto quando os (Sin embargo, cuando los) trofozoítos penetram na mucosa intestinal ocorre uma reação inflamatória levando à destruição do tecido envolvido (que lleva a la destrucción del tejido involucrado).¹ Muitos estudos procuram identificar e caracterizar a base molecular da reação (de la reacción) citolítica, que é iniciada a partir do contato (del contacto) íntimo entre a célula-alvo e o (con el) parasito. Após contato estabelecido pelo (por el) reconhecimento de moléculas de galactose (Gal) ou N-acetil-D-galactosamina (GalNAc), presentes na superfície das (en la superficie de las) células-alvo, por lectinas expressas pelo parasito, dispara-se uma cascata (una cascada) de sinalização intracelular, ocorrendo liberação de moléculas proteicas conhecidas como poros amebianos,⁵ os quais se inserem na (que se insertan en la) membrana da célula-alvo formando canais iônicos.^6,7 Além disso, o (Además, el) parasito libera cisteína proteinases que são responsáveis pela degradação da matriz extracelular facilitando, dessa forma, a invasão tecidual (la invasión del tejido).⁸ A infecção assintomática é a forma mais comum da doença e ocorre em (constituye la forma más común de la enfermedad y ocurre en) cerca de 90% dos casos. Os demais casos são sintomáticos e caracterizados, principalmente, pela (por la) disenteria amebiana. Aproximadamente 1% desses indivíduos sofre piora no (presenta empeoramiento del) estado clínico devido a complicações como a colite fulminante ou (como la colitis fulminante o) desenvolvimento de abscessos hepáticos, sendo responsáveis por quase todos os casos de óbito (por casi todos los casos de muerte).
Esta discrepância clínica tem sido tema de discussão há muitos anos (hace muchos años). Em 1925, o parasitologista francês Alexandre Joseph Émile Brumpt, formulou a hipótese de que tal diferença poderia ser explicada pela presença de duas (por la presencia de dos) espécies morfologicamente idênticas: uma delas (una de ellas) patogênica e a outra comensal.⁹ Entretanto, a sua ideia não foi aceita (no ha sido aceptada) de imediato. Até que em (Hasta que en el año) 1993 dados (datos) imunológicos, bioquímicos e genéticos forneceram (brindaron) evidências para Diamond e Clark redescreverem a espécie em dois (en dos) organismos, deixando o (dejando el) antigo nome E. histolytica (Schaudinn, 1903) para a patogênica e criando uma nova designação para aquela não patogênica (Entamoeba dispar),¹⁰ como proposto anteriormente. A E. dispar vive como um comensal estável e avirulento (no virulento) produzindo um (produciendo un) estado de portador assintomático, sendo aproximadamente nove vezes mais (nueve veces más) prevalente que a E. histolytica.¹¹ Dessa forma, a infecção causada pela E. histolytica encontra-se superestimada (se encuentra sobrestimada). Uma nova estimativa sugere que a E. histolytica seja (es) responsável por 10% de todos os casos (los casos) mundiais (ou seja, por 50 milhões) enquanto a E. dispar colonize o restante dos indivíduos.¹² Além da (Además de la) E. dispar, outras espécies de ameba são capazes de colonizar o homem e não produzir ações patogênicas,tais como a (el hombre y no producir acciones patogénicas, tales como) Entamoeba hartmanni, Entamoeba coli e Entamoeba moshkovskii.

O diagnóstico clínico da amebíase é presuntivo e os sinais e (es presuntivo y los signos y) sintomas são inespecíficos, podendo ser confundidos com os de outras (como los de otras) infecções intestinais. O diagnóstico laboratorial é realizado rotineiramente (de rutina) através da demonstração microscópica de cistos e/ou trofozoítos no sedimento fecal, não permitindo a detecção de variações interespecíficas entre a E. histolytica e espécies não patogênicas (em especial, E. dispar e E. moshkovskii).¹³ Os indivíduos infectados pelas espécies não patogênicas não requerem tratamento e a quimioterapia inadequada ou desnecessária (o innecesaria) devem ser evitadas por causarem importantes efeitos adversos,^14,15 elevação de custos ao (costos al) sistema de saúde e possibilidade do desenvolvimento (posibilidad de aparición) de resistência às drogas comumente utilizadas.^16,17 O diagnóstico espécie-específico é relevante não apenas para os (no sólo para los) indivíduos sintomáticos, mas também para todos os infectados devido à facilidade de transmissão pelo contato pessoa-pessoa (por el contacto persona a persona), especialmente em países em desenvolvimento onde as (donde las) condições de higiene são precárias. Com base no exposto, um (Con base en lo expuesto, un) diagnóstico laboratorial barato e específico para a E. histolytica representa um desafio para comunidade científica, dada a importância do tratamento dos indivíduos verdadeiramente infectados por este patógeno.
O (El) objetivo desta revisão foi descrever as principais metodologias disponíveis para o diagnóstico da amebíase, suas vantagens e limitações, bem como as (así como las) perspectivas para o desenvolvimento de novas metodologias para esta finalidade.

Microscopia óptica

O diagnóstico microscópico de preparações fecais coradas pelo lugol (fecales teñidas con lugol) para pesquisa de cistos é a ferramenta mais (es la herramienta más) utilizada no diagnóstico da amebíase. Sua execução é simples, barata e não exige equipamentos sofisticados. No entanto, é (Sin embargo, es) incapaz de diferenciar a E. histolytica da E. dispar e E. moshkovskii, tornando o seu diagnóstico presuntivo. Por esta razão, a Organização Mundial da Saúde (OMS) propõe que o (sugiere que el) diagnóstico da amebíase baseado nesta metodologia deva referir-se à (debe referirse a la) infecção causada pelo complexo E. histolytica/dispar/moshkovskii.¹⁸ Apesar de um resultado positivo para o complexo o indivíduo infectado não deve ser submetido à (no debe someterse al) tratamento quimioterápico.
A E. histolytica apresenta duas formas morfológicas distintas: cistos e trofozoítos. Em espécimes fecais a fresco (fecales frescos), os trofozoítos são mais frequentemente observados por seu extenso (su amplio) pleomorfismo em sua superfície e emissão (con emisión) de pseudópodes, os quais arrastam o corpo da ameba e o seu (que arrastran el cuerpo de la ameba y su) núcleo, que nem sempre é visível (que no siempre es visible) (Figura 1a). Medem (Miden) entre 12 e 60 µm de diâmetro, em média um pouco mais de 20 µm. Os pseudópodes são rapidamente estendidos e sua (se extienden rapidamente y su) forma pode variar de curto (entre corto), arredondado e largo (y largo), a longo e digitiforme. O ectoplasma claro e hialino forma a camada mais (la capa más) extensa do corpo da ameba e flui para fora (y fluye para fuera) formando o pseudópode. O endoplasma, mais granuloso, flui lentamente para dentro do pseudópode à medida que a ameba move-se na (se mueve en la) direção em que este foi estendido (se extendió). A mobilidade é usualmente progressiva e direcional, e não aparentemente sem rumo (sin rumbo), como observado nas outras amebas intestinais. Possui um (Tiene un) núcleo esférico e vesiculoso, com uma membrana nuclear delicada, porém distinta (pero distinta). Em sua superfície interna observa-se um número variável de cromatina periférica, distribuída de forma homogênea. No centro do núcleo há uma (En el centro del núcleo hay una) pequena massa de cromatina, denominada cariossoma central (Figura 1b). Geralmente, observam-se eritrócitos no citoplasma de trofozoítos de E. histolytica.^18-21

No entanto, trofozoítos de E. dispar eventualmente podem apresentar eritrócitos fagocitados.²² Experimentos in vitro demonstraram que a taxa (la tasa) de eritrofagocitose é significativamente maior nas (es significativamente más elevada en las) espécies de E. histolytica do que em qualquer outra espécie de ameba.²³ Nos (En los) casos de amebíase crônica é comum a ausência de eritrócitos fagocitados, sugerindo que a eritrofagocitose seja indicativa da (es indicación de) infecção por cepas invasivas.²⁴ Eritrócitos recentemente ingeridos aparecem como corpos refringentes, de cor esverdeada muito (color verdoso muy) pálida. Bactérias também podem ser visualizadas em seu citoplasma. Trofozoítos em degeneração apresentam formação (presentan la formación) de vacúolos citoplasmáticos, facilmente identificados através da microscopia óptica. O diagnóstico através da pesquisa de trofozoítos ocorre somente em (tiene lugar sólo en) condições disentéricas e a demora no processamento do material fecal implica na redução da (significa la redución de la) sensibilidade do teste, pois os mesmos (del análisis, ya que estos) permanecem viáveis por apenas 20 minutos a 3 horas após sua (luego de su) eliminação.^20,25,26 Ocasionalmente, são vistos trofozoítos móveis em amostras fecais mantidas sob (muestras fecales almacenadas bajo) refrigeração durante um prazo de até quatro (un período de hasta cuatro) horas, apesar de se desintegrarem rapidamente em amostras não fixadas (no fijadas).^1,2,27 Já os (Los) cistos podem ser facilmente reconhecidos em preparações coradas pelo lugol por sua parede (por su pared) hialínica refringente. São geralmente esféricos, mas podem ter (pero pueden tener) forma ligeiramente ovoide ou irregular, variam de 10 a 20 µm de diâmetro e contêm de um a quatro núcleos no seu (y contienen de uno a cuatro núcelos en su) interior. O citoplasma torna-se verde-amarelado na presença (se vuelve verde-amarillo en presencia) de vacúolos de glicogênio que se coram de castanho-amarelado (se tiñen de castaño-amarillento); a membrana nuclear e o cariossoma são ligeiramente visíveis e coram-se de castanho-claro (Figura 2).

A microscopia óptica possui baixa (tiene baja) sensibilidade (cerca de 60%) e pode produzir resultados falso-positivos. De fato (De hecho), diversos fatores podem afetar os (pueden afectar los) resultados como o atraso no processamento do (la demora para el procesamiento del) material, analista mal treinado (mal entrenado), dificuldade na diferenciação de trofozoítos não móveis (no móviles) de células epiteliais, uso de coletores (recolectores) contaminados, presença de substâncias interferentes como antibióticos, laxantes, antiácidos, antidiarreicos ou enemas, número inadequado de amostras fecais analisadas, preservação inadequada das amostras e liberação intermitente de cistos e/ou trofozoítos.^13,28,29
Embora as (Aunque las) técnicas de concentração auxiliem o diagnóstico microscópico nem sempre é (no siempre es) possível visualizar as amebas no sedimento fecal.³⁰ O uso de colorações permanentes, como o tricrômio ou a hematoxilina férrica, não deve ser negligenciado pois auxiliam na (ya que ayudan en la) identificação morfológica, apesar de não diferenciar as amebas pertencentes ao complexo E. histolytica/dispar/moshkovskii. Entretanto encarecem o (encarecen el) diagnóstico, demandam mão-de-obra (demandan mano de obra) especializada e consomem tempo nos (y consumen tiempo en los) casos da análise de grande quantidade de amostras. Apesar de todas estas desvantagens, a microscopia óptica é uma (es una) metodologia barata, rápida e bastante útil em estudos de triagem (de rastreo).

Métodos de cultivo

Os meios (Los medios) de cultivo podem ser usados para o diagnóstico da E. histolytica, no entanto são pouco utilizados na rotina (en la rutina) laboratorial, uma vez que são (ya que son) de difícil execução, de alto custo, baixa (costo, baja) sensibilidade,^30,31 e não diferenciam por si só as (sí solos las) espécies do complexo E. histolytica/dispar/moshkovskii. Além disso, trofozoítos de E. histolytica tornam-se menos virulentos e perdem sua (pierden su) capacidade de encistamento, inviabilizando estudos de patogenia.³² Por outro lado, o cultivo das amebas é de fundamental importância para estudos sobre a bioquímica, fisiologia e metabolismo do parasita;^33,34 produção de antígenos e anticorpos mono e policlonais e sua utilização no diagnóstico sorológico; estudos diferenciais entre cepas patogênicas e não patogênicas por meio da (por medio de la) eletroforese de isoenzimas (zimodema);^35,36 triagem de novos medicamentos, bem como (así como) estudos de susceptibilidade e resistência às drogas amebicidas comumente utilizadas para o tratamento da doença (de la enfermedad);^34,37 infecção de modelos experimentais para estudo de patogenia;³⁸ conhecimento da organização do microrganismo em nível ultra-estrutural;³⁴ dentre outros (entre otros).

O cultivo pode ser realizado em conjunto com bactérias encontradas nas fezes (en la materia fecal). Quando as amebas crescem associadas a uma microbiota desconhecida, o cultivo é dito xênico (se dice que el cultivo es xénico) (em grego, xenos significa desconhecido); se o (si el) organismo convive com uma única bactéria ou protozoário conhecido, o cultivo é denominado monoxênico. Quando o cultivo contém várias espécies conhecidas associadas, ele é (él es) polixênico. E, finalmente, quando as amebas crescem na ausência de outros microrganismos é conhecida como axênico.
A E. histolytica foi primeiramente cultivada por Boeck e Drbohlav em 1925.³⁹ Nesta ocasião foi (En esta oportunidad fue) utilizado um meio de cultura difásico inclinado contendo ovo em sua (huevo en su) composição, que foi desenvolvido inicialmente para isolamento de flagelados (aislar flagelados) intestinais. Em seguida, Dobell e Laidlaw⁴⁰ preconizaram a (preconizaron la) utilização de amido de arroz como fonte (almidón de arroz como fuente) de carboidrato, modificação que ainda permanece em todos os meios de cultura (en todos los medios de cultivo) xênica usados atualmente. O cultivo da E. histolytica na presença de uma (en presencia de una) única espécie de bactéria foi inicialmente descrita por Cleveland e Sanders⁴¹ em meio (en medio) difásico. Os mais (Los más) utilizados para estes tipos de cultivo são os meios de Shaffer-Frye (MS-F),⁴² Pavlova,⁴³ (Figura 3) Robinson⁴⁴ e o TYSGM-9.⁴⁵ Já o cultivo monoxênico com tripanossomatídeos (Trypanosoma cruzi) foi utilizado com sucesso por muitos pesquisadores.¹⁰ Juntamente como T. cruzi, o protozoário Crithidia fasciculata são os organismos de escolha (elección) para cultivo monoxênico da E. histolytica.⁴⁶ Este cultivo é de (es de) uso limitado, exceto como estágio (excepto como etapa) transicional entre os cultivos polixênicos e axênicos.

O cultivo axênico da E. histolytica, por sua vez, foi descrito por Diamond em 1961.⁴⁷ O meio difásico utilizado (TP-S-1) era um complexo contendo Agar nutriente enriquecido com soro e (con suero y) vitaminas. Em 1968, Diamond introduziu o meio monofásico TYS-33, substituindo o TP-S-1.⁴⁸ Posteriormente foi descrito o meio YI-S como alternativa ao TYI-S-33.⁴⁹ Os principais componentes dos meios axênicos são peptídeos e aminoácidos (tripticase e caseína), ácidos nucleicos (extrato de leveduras), carboidratos (glicose), lipídeos (soro) e vitaminas.
Segundo Sehgal e cols., o cultivo de E. histolytica para análise de isoenzimas a partir de amostras de fezes e abscessos hepáticos não é (no es) útil para a prática laboratorial.⁵⁰ Além disso, a (Además, la) identificação específica com base na análise de zimodemas pode ser comprometida em casos de contaminação do meio ou em (del medio o en los) cultivos mistos.⁵¹ De fato, um dos (De hecho, uno de los) principais problemas no cultivo das amebas é o crescimento de microrganismos não desejados (no deseados), como bactérias, fungos e (hongos y) outros protozoários.⁵² Um agente contaminante bastante comum é o Blastocystis hominis que, em virtude de sua elevada taxa (su elevado índice) de crescimento, impede o desencistamento de cistos e a visualização de trofozoítos, levando a (llevando a) resultados falso-negativos.

Detecção de anticorpos circulantes

A detecção de anticorpos é uma ferramenta (es una herramienta) que pode auxiliar o diagnóstico da amebíase. Entretanto, indivíduos residentes em áreas endêmicas estão constantemente expostos à infecção, tornando o diagnóstico incapaz de distinguir infecções recentes de anteriores devido à persistência de anticorpos circulantes.^53,54 Estes testes possuem (Estas pruebas tienen) resultado mais fidedigno quando são (cuando son) utilizados em áreas não autóctones.^55-57 De todo modo, a combinação de testes (la combinación de pruebas) sorológicos com a detecção do parasito (pesquisa de antígenos ou PCR) oferece uma maior sensibilidade diagnóstica.⁵⁸

Anticorpos séricos anti-E. histolytica podem ser detectados em 75%-80% dos indivíduos com infecção sintomática. Os (Los) métodos mais utilizados para esta finalidade incluem: ELISA,^59-66 hemaglutinação indireta,^60,67-70 contraimunoeletroforese,^31,67,71-74 testes (pruebas) de difusão em gel,⁷⁵ fixação do (fijación del) complemento,^60,62 imunofluorescência indireta,^68,75-77 e aglutinação em partículas de látex.^60,62,63

Os testes de ELISA disponíveis no mercado pesquisam a presença de anticorpos IgM ou IgG anti-lectinas,^53,78 o que representa uma desvantagem no início da (una desventaja al comienzo de la) infecção. De fato, anticorpos específicos (IgG anti-lectinas ou IgM anti-E. histolytica, principalmente nos casos de colite amebiana) começam a ser produzidos somente uma semana após aparecimento da (sólo una semana luego de la aparición de la) sintomatologia.⁷⁹ Um estudo utilizando 100 indivíduos portadores de colite amebiana mostrou que (demostró que) os anticorpos IgM e IgG anti-lectina, dosados por ELISA, apresentaram uma sensibilidade de 45.1% e 5.6%, respectivamente, quando pesquisados na (cuando investigados en la) primeira semana após aparecimento dos sintomas clínicos. No entanto, sofreram (presentaron) aumento para 79.3% e 93.1%, respectivamente, após um período (luego de un período) superior a uma semana depois do (después del) aparecimento dos sintomas clínicos.⁷⁸ Estes dados (Estos datos) demonstram que os testes de ELISA utilizados para pesquisa de anticorpos podem fornecer (pueden mostrar) resultados falso-negativos nos primeiros dias de infecção. Além do mais (Además), resultados falso-positivos podem ocorrer devido à (pueden ocurrir debido a) colonização do lúmen intestinal pela (por) E. díspar pois, segundo alguns autores, este protozoário é capaz de estimular a secreção de anticorpos anti-lectina.^80,81

Apesar destas limitações, o ELISA é um dos (es uno de los) métodos mais utilizados em todo o (en todo el) mundo. É amplamente empregado para o (Se utiliza ampliamente para el) diagnóstico da amebíase, principalmente nos casos de abscessos hepáticos. Segundo alguns autores, a sensibilidade do teste chega a (la sensibilidad del análisis alcanza el) 100%,^60,82 sendo um teste de escolha (elección) para diagnóstico de abscessos hepáticos: 95% dos indivíduos com esta apresentação clínica possuem (tienen) altos níveis séricos de IgG anti-E. histolytica, por volta de uma (alrededor de una) semana após o aparecimento dos sintomas.⁸³ Ainda que possua (Aún con) alta sensibilidade, o ELSIA pode produzir resultados falso-negativos. Nestes casos, os testes (En estos casos, los análisis) devem ser repetidos ou confirmados através de outras metodologias.

Imunoglobulinas específicas da classe A (IgA anti-lectina), presentes na mucosa intestinal, estão diretamente relacionadas à proteção imunológica contra a colonização da mucosa por trofozoítos de E. histolytica, podendo servir como um eficiente indicador de proteção.⁸⁴ Recomenda-se a utilização do ELISA de captura para IgA quando o objetivo for avaliar o (cuando el objetivo es evaluar el) nível de proteção da mucosa intestinal contra a colonização da E. histolytica.

Quando os portadores assintomáticos da E. histolytica infectam-se pelo HIV, a amebíase latente pode tornar-se ativa (puede volverse activa), progressiva, invasiva e o seu diagnóstico ainda mais importante.^69,85 Nesta circunstância o diagnóstico da amebíase pode ser realizado através da detecção de anticorpos anti-E. histolytica por testes sorológicos. No entanto, estudos (Sin embargo, estudios) demonstraram que a sensibilidade diagnóstica em casos de abscessos hepáticos foi de apenas 72.4% dentro de uma a duas semanas após aparecimento dos sintomas clínicos, havendo aumento para 86.9% ao final da (en el final de la) terceira semana e declinando bastante a partir da sexta semana.⁸⁵ A depleção imunológica de células T e B nos indivíduos infectados pelo HIV diminui a (reduce la) síntese de imunoglobulinas, fornecendo resultados falso-negativos nos testes sorológicos. Por esta razão, os testes para detecção de antígenos são mais indicados no diagnóstico da amebíase.

Detecção de antígenos
Pesquisa de coproantígenos

São vários os (Son varios los) testes utilizados para detecção de antígenos na amebíase. Dentre estes, o ELISA possui vantagens quando comparado a outras (tiene ventajas cuando se compara con otras) metodologias comumente utilizadas, pois é (ya que es) capaz de diferenciar a infecção causada pela E. histolytica da colonização intestinal provocada pelas espécies não patogênicas, possui valores elevados de sensibilidade e especificidade, e o uso (y el uso) de placas com 96 poços permite a realização de estudos epidemiológicos em larga escala.⁸⁶

A imunocromatografia também já foi utilizada para o (ya se utilizó para el) diagnóstico laboratorial da amebíase. Este teste consiste em uma tira recoberta com anticorpos específicos para um antígeno de 29 kDa de E. histolytica/díspar.^87,88 Ao ser comparada com a microscopia óptica apresentou sensibilidade e especificidade de 96% e 99.1%, respectivamente.⁸⁸ No entanto, quando comparada ao ELISA foi observada uma especificidade de apenas 68.3%.⁸⁷ Por outro lado, o teste de ELISA quando comparado à microscopia óptica apresentou sensibilidade e especificidade de 73.5% e 97.7%, respectivamente, em um estudo utilizando turistas alemães recém chegados (alemanes recién llegados) de áreas endêmicas.⁸⁹ Os testes de ELISA atualmente disponíveis no mercado (en el mercado) utilizam anticorpos monoclonais específicos para as lectinas amebianas (E. histolytica test II; TechLab, Balcksburg, Va) ou para antígenos ricos em serina (Optimum S kit; Merlin Diagnostika, Borhei,-Hersel, Alemanha).

Na pesquisa de antígenos, além do material fecal, outras amostras podem ser usadas para detecção da E. histolytica como saliva, soro e (suero y) fluido de abscessos hepáticos. Haque e cols. e Abd-All e cols. diagnosticaram a maioria de seus pacientes utilizando o teste de ELISA específico para lectinas de E. histolytica no fluido dos abscessos hepáticos e na saliva de indivíduos portadores de abscessos hepáticos, respectivamente.^78,90

As principais vantagens destes testes são sua praticidade e os (son su practicidad y los) altos valores de sensibilidade e especificidade. No entanto (Sin embargo), estas metodologias são limitadas para pesquisa de antígenos em amostras fecais congeladas ou preservadas, pois os (ya que los) antígenos podem ser desnaturados (desnaturalizados) durante o processo de fixação do (fijación del) espécime a ser estudado. Além disso, não há (Además, no existen) estudos que demonstrem que cistos presentes em fezes formadas sejam reconhecidos (son reconocidos) por esta metodologia, pois não seriam capazes expressar lectinas em sua superfície, como ocorre nas formas trofozoíticas.
Pelo exposto há uma (Por todo el expuesto existe una) variedade de métodos capazes de distinguir a infecção causada pela E. histolytica da colonização pela E. dispar ou E. moshkovskii. Alguns deles são capazes de realizar a diferenciação específica, no entanto possuem sensibilidade e especificidade variadas, muitas vezes havendo necessidade da realização de testes mais sensíveis como a reação de amplificação de ácidos nucleicos ou identificação por meio de beads recobertas por antígenos espécie-específicos.

Amplificação de ácidos nucleicos

A PCR é uma técnica que reproduz a habilidade natural de replicação do DNA, possui boa reprodutibilidade, alta sensibilidade e especificidade, sendo capaz e detectar um único trofozoíto por mg de fezes.⁹¹ Vem sendo (Ha sido) bastante utilizada em substituição à microscopia óptica, cultura e até mesmo aos (y hasta los) testes de ELISA.⁹² Outra vantagem é a possibilidade de diferenciar as espécies pertencentes ao complexo E. histolytica/dispar/moshkovskii⁹³ e de utilizar outros materiais biológicos (como fluidos), além de espécimes fecais.^51,94-96 Por estes motivos, a PCR é a metodologia recomendada pela OMS para o diagnóstico da amebíase. A despeito das inúmeras (Respecto de las varias) vantagens apresentadas, a PCR também possui limitações. Tecnicamente é mais complexa e sua execução mais demorada (es más compleja y su ejecución tarda más) que o ELISA, possui custo (tiene costo) elevado durante seu processo de implantação, dificultando sua utilização no diagnóstico de rotina, principalmente em países em desenvolvimento.^20,58 Além do mais, deve-se levar em (Además, se debe tener en) consideração que é uma (que es una) técnica susceptível à contaminação e, consequentemente, a resultados falso-positivos. Somado a isso, (Asimismo) resultados falso-negativos são passíveis de ocorrer em virtude da presença de inibidores inespecíficos presentes nas amostras fecais.⁶⁶ A análise dos dados (de los datos) deve ser realizada por indivíduos treinados (sujetos entrenados), com experiência nesta metodologia e é (y es) bastante laboriosa, pois há necessidade de preparação de géis de agarose corados pelo (geles de agarosa teñidos con) brometo de etídio, uma substâcia cancerígena (Figura 4).

A realização da PCR deve ser precedida por metodologias de concentração de cistos, dada à liberação intermitente de cistos nas amostras fecais. Diversas técnicas de concentração já foram (ya han sido) descritas na literatura. A concentração de cistos utilizando formol/éter ou formol/acetato de etila é a metodologia de escolha para esta finalidade.^97-99 Os métodos de extração de DNA das amostras fecais e a utilização de iniciadores específicos constituem o ponto chave para um diagnóstico seguro. Existem vários métodos de extração de DNA; os que utilizam colunas (los que utilizan columnas) cromatográficas são os que fornecem maior quantidade de material genético livrando-os (liberándolos) de inibidores inespecíficos da DNA polimerase.¹⁰⁰ Outros métodos de extração também podem ser empregados com (ser utilizados con) sucesso, como o método do fenol/clorofórmio.¹⁰¹ A principal vantagem destas metodologias é a possibilidade de se trabalhar com amostras fixadas em (fijadas en) formol.^102,103 A fixação em formol em concentrações que variam de 1% a 10% é muito importante para a preservação e não diminui a (y no reduce la) capacidade de amplificação da PCR em um período de até 7 dias.¹⁰⁴

A PCR possui bom desempenho quando comparada às (tiene un buen desempeño cuando se la compara con las) metodologias descritas anteriormente. Um estudo realizado em 2001 demonstrou uma sensibilidade de 94% e especificidade de 100%.⁹⁹ Diversas variantes da PCR foram utilizadas, apresentando bons (presentando buenos) resultados, como a PCR multiplex,^66,99 a PCR em tempo (en tiempo) real,¹⁰⁵ e a amplificação aleatório de DNA polimórfico (RAPD).¹⁰⁶ A PCR em tempo real, por exemplo, combina o princípio da PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por meio de (mediante) fluorescência. O método utiliza um sistema fluorescente em plataforma capaz de detectar a luz oriunda das reações (de las reacciones) de amplificação. Esta metodologia possui vantagem sobre a PCR convencional por permitir que a amplificação, detecção e quantificação do material genético ocorram em uma única etapa, agilizando a obtenção dos resultados, diminuindo o risco (reduciendo el riesgo) de contaminação e, consequentemente, proporcionando maior confiabilidade nos resultados. Além disso, a PCR em tempo real gera (genera) resultados numéricos, os quais são mais fáceis (que son más fáciles) de interpretar do que a visualização dos fragmentos amplificados em géis corados (geles teñidos), como ocorre na PCR convencional. Com base nestas (Sobre la base de estas) características, esta metodologia apresenta maior sensibilidade para detectar a E. histolyticae diferenciá-las de espécies não patogênicas quando comparada à PCR convencional.¹⁰⁷

Detecção de antígenos por meio de microesferas (beads) magnéticas

A tecnologia para detecção de antígenos em amostras biológicas por meio de microesferas magnéticas constitui um sistema analítico, do tipo multiplex, baseado em três (con base en tres) elementos principais: o suporte sólido, os marcadores fluorescentes e um fluxo (y un flujo) fluorimétrico. O suporte sólido é representado por microesferas de poliestireno de 5.6 mm de diâmetro que possuem grupamentos (poseen grupos) carboxílicos negativamente carregados, permitindo o acoplamento ou fixação covalente (el acoplamiento o fijación covalente) de diferentes moléculas portadoras de grupos amina em sua superfície, tais (amino en su superficie, tales) como antígenos, anticorpos, ácidos nucleicos ou outros tipos de receptores ou ligantes.^108,109

Atualmente esta tecnologia permite detectar simultaneamente até 100 analitos graças a (hasta 100 analitos gracias a) utilização diferencial de dois (dos) marcadores fluorescentes internos (laranja ou vermelho), criando conjuntos de esferas com características únicas. Dessa maneira, cada conjunto carrega consigo uma (carga consigo una) assinatura espectral definida pela combinação destes fluoróforos. Microesferas com propriedades espectrais definidas recobertas (recubiertas) por sondas específicas para um patógeno podem hibridizar (pueden hibridar) com material genético amplificado por meio de PCR e ser usadas para detectar um único patógeno em uma mistura complexa (mezcla compleja). Dessa maneira, as fitas (las cintas) hibridizadas sobre essas microesferas são marcadas com moléculas fluorescentes e as esferas são (y las esferas son) individualmente analisadas por um laser vermelho (láser rojo) (635 nm) que excita os fluorocromos internos e emitem dois comprimentos (y emiten dos tamaños) de onda diferentes, permitindo identificar a esfera específica para cada antígeno, e um laser verde (532) que excita o fluorocromo do conjugado que está fixado na (del conjugado que está fijo en la) superfície da esfera, permitindo quantificar o DNA alvo ligado. No geral (En general) este fluorocromo é a ficoeritrina por favorecer um rendimento quântico elevado, possuir fraca (tiene débil) fotosensibilidade e excelente estabilidade.

Este método tem sido empregado para a (ha sido utilizado para la) detecção e diferenciação de diversas espécies de vírus, fungos, (hongos), protozoários e estruturas antigênicas.^110-119 O sistema Luminex para detecção de E. histolytica foi recentemente estabelecido com sensibilidade e especificidade entre 83% e 100% em comparação com a PCR em tempo real.¹²⁰ Recentemente Navidad e cols.¹¹⁹ validaram um teste laboratorial multiplex baseado na metodologia do Luminex para detecção de patógenos gastrintestinais causadores de diarreia aguda. Após validação do teste os (Luego de la validación de la prueba los) autores observaram encurtamento no (acortamiento en el) tempo de identificação de múltiplos patógenos em uma única reação com um tempo (con un tiempo) de resposta menor que 6 h desde o momento do recebimento dos (momento de recepción de los) espécimes fecais. O ácido nucleico de E. histolytica foi detectado em 29 amostras que anteriormente não havia sido diagnosticado por meio da microscopia óptica. A PCR em tempo real foi capaz de amplificar somente 5 destas (sólo cinco de estas) 29 amostras. Apesar do excelente desempenho do Luminex frente às demais (frente a las otras) metodologias usadas para o diagnóstico da amebíase os autores afirmaram que outros estudos precisam ser realizados para justificar tamanha discrepância. Por outro lado, não foram observadas diferenças significativas para os demais patógenos analisados, como os vírus (adenovírus, rotavírus e norovírus), Cryptosporium spp. e algumas bactérias entéricas, os quais (que) apresentaram altos valores de sensibilidade (90%-100%) e especificidade (99%-100%). De modo semelhante, Santos e cols.¹¹⁰ descreveram o desenvolvimento de uma técnica multiplex de hibridização direta usando a tecnologia Luminex, para uma detecção rápida e simultânea da E. histolytica e de amebas não patogênicas. Neste estudo, os produtos da PCR foram produzidos com sondas biotiniladas e misturadas às (y mezcladas a las) microesferas previamente acopladas a sondas capazes de distinguir as espécies de Entamoeba. Em seguida, os produtos da PCR foram incubados com estreptovidina-ficoeritrina, os quais ligaram a (que ligaron la) biotina nos produtos amplificados da PCR. De acordo com estes autores, a metodologia Luminex é uma ferramenta capaz de detectar e distinguir espécies de Entamoeba, ainda que em misturas complexas. Portanto, esta metodologia pode ser usada para melhorar o diagnóstico da amebíase bem como ser (así como es) uma importante ferramenta em estudos que objetivam investigar a circulação das (circulación de las) diversas espécies de Entamoeba no mundo.

A tecnologia Luminex apresenta diversas vantagens quando comparada às demais (cuando se la compara con las demás). Utiliza volumes reduzidos de amostra e analisa (y analiza) diversos parâmetros em uma única amostra, graças à marcação interna das (gracias a la marcación interna de las) esferas. Teoricamente é possível analisar simultaneamente, em uma mesma amostra biológica, até 100 analitos diferentes. O tempo de análise é curto e pode-se fazê-la em (es corto y puede ser realizado en) muitas amostras ao mesmo tempo (high-throuhput technology). Por ser um sistema aberto esta tecnologia permite ao pesquisador ou analista clínico adquirir separadamente as esferas e realizar o diagnóstico do que desejar (de lo que se quiera) variando desde doenças virais em (enfermedades virales en) bovinos até patógenos gastrintestinais em humanos. Apesar da utilização desta tecnologia ser sedutora (de esta tecnología es seductora) a priori, ela apresenta limitações de ordem técnica e econômica que inviabilizam seu emprego (inhabilitan su uso) como teste diagnóstico em países em desenvolvimento. De fato, o custo do (el costo del) equipamento e dos insumos não é negligenciável. Outra desvantagem é a (despreciable. Otra desventaja es la) impossibilidade de detectar anticorpos de diferentes isotipos em uma mesma mistura reacional (mezcla de reactivos). Caso se deseje pesquisar em uma mesma amostra a presença (En caso de que se desee investigar en una misma muestra la presencia) de IgA e IgG, por exemplo, esta deve ser efetuada em poços separados (pozos separados). Apesar do ganho de tempo ao (A pesar de la ganancia de tiempo al) realizar diversas análises simultaneamente em uma única amostra, a etapa de contagem das esferas é mais longa que a leitura da (conteo de las esferas es más largo que la lectura de la) densidade ótica no ELISA convencional. Enquanto um leitor de microplacas efetua a medida fotométrica de 96 poços em três segundos, o fluorímetro de fluxo necessita de 10 a 90 segundos para adquirir um número suficiente de medidas de fluorescência em uma mistura reacional. Quanto mais antígenos pesquisa-se em uma amostra mais tempo é requerido para a leitura das fluorescências.

Perspectivas e conclusão

Apesar do avanço no (Aun con el avance en el) diagnóstico laboratorial da amebíase, os laboratórios clínicos continuam utilizando rotineiramente a microscopia óptica e, muitos deles, não (y, muchos de ellos, no) evidenciam em seus laudos a (en sus informes la) informação de que o indivíduo está infectado por uma das três espécies do complexo E. histolytica/dispar/moshkovskii, e sim somente pela E. histolytica. Aliado a este fato (Aunado a este hecho) médicos desatualizados desconhecem esta informação e tratam os pacientes sem a confirmação da espécie. Daí a (De ahí la) importância do desenvolvimento de uma metodologia barata, de fácil aplicação e que seja (y que sea) capaz de efetuar um diagnóstico espécie-específico. Por isso que a (Por este motivo, la) combinação de metodologias como a pesquisa de anticorpos circulantes, em caso de doença invasiva, e a pesquisa de antígenos por meio da PCR deve ser preconizada com o (preconizada con el) objetivo de aumentar a assertividade diagnóstica. Dados epidemiológicos e avaliações (y evaluaciones) auxiliares como a colonoscopia, a biópsia de lesões intestinais e, no caso (y, en el caso) de abscesso hepático, a avaliação do fluido pela PCR não devem ser negligenciados e podem auxiliar na (y pueden ayudar con la) conclusão diagnóstica. O desenvolvimento de ferramentas moleculares do tipo multiplex, incluindo a PCR em tempo real e a tecnologia Luminex, encontra-se em evidência e vem apresentando resultados promissores por serem capazes de reduzir o tempo para a (por ser capaces de reducir el tiempo para la) conclusão diagnóstica (turnaround time), terem capacidade de detecção de vários patógenos utilizando pequenos volumes de amostra e efetuarem o (y realizar el) diagnóstico diferencial das espécies pertencentes ao complexo E. histolytica/dispar/moshkovskii além de outros patógenos intestinais como protozoários, vírus e bactérias. Entretanto, a despeito de todos estes (a pesar de todos estos) benefícios,o impacto econômico destas tecnologias representa uma limitação ao seu uso nos (de su uso en los) países onde a amebíase representa um problema de Saúde Pública.
A busca de novos marcadores laboratoriais deve ser estimulada entre os grupos de pesquisa. Uma alternativa seria o isolamento (sería el aislamiento) de proteínas específicas por meio de estudos de proteômica para cada uma das três (cada una de las tres) espécies do complexo, a produção de anticorpos monoclonais e a padronização do teste por meio de (y la estandarización de la prueba con) imunocromatografia por fluxo lateral, a qual (que) poderia ser utilizada em campo (point-of-care) por um custo acessível até por países economicamente menos favorecidos. Mais ideal ainda seria se essas proteínas fossem expressas ou secretadas (Sería ideal si esas proteínas fueran expresadas o segregadas) por cistos e trofozoítos, favorecendo o diagnóstico de indivíduos sintomáticos e dos portadores sãos (y de los portadores sanos). Com base no exposto, torna-se evidente que o diagnóstico da amebíase constitui um desafio para a comunidade científica, posto que há (dado que hay) necessidade do desenvolvimento de metodologias que forneçam (brinden) informações seguras sobre a saúde da população a um preço acessível a todos (la salud de la población com costos accesibles para todos).

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