Introducción
De los diversos microorganismos asociados con enfermedad cardiovascular (ECV), Chlamydophila pneumoniae y herpes virus son los únicos que se han encontrado intactos (1). El microorganismo TWAR se describió como causa de infección respiratoria en 1986 (2). En 1989 se lo identificó como una nueva especie de Chlamyidia, a la cual se le denominó Chlamydia pneumoniae (3). En 1999, la taxonomía de la familia Chlamydiaceae se revisó extensamente sobre las bases de estudios genómicos. Antes de 1999, la familia consistía de un género, Chlamydia, con 4 especies. Ahora la familia se ha dividido en 2 géneros, Chlamydia y Chlamydophila. C. trachomatis se retuvo en el género pero C. psittaci y C. pneumoniae se transfirieron al nuevo género, Chlamydophila (4). En 1988 se informó por primera vez la presencia de anticuerpos contra C. pneumoniae en pacientes con infarto agudo al miocardio y con enfermedad cardíaca coronaria crónica (5). A partir de ese momento, se ha acumulado rápidamente información sobre la asociación de C. pneumoniae y aterosclerosis. Más de 20 estudios seroepidemiológicos han confirmado cierta asociación (6-12), aunque otros no la han encontrado (13-15). En 1992, se detectó C. pneumoniae en estrías grasas de arteria coronaria y en placas ateromatosas mediante microscopia electrónica e inmunocitoquímica (16) y en 1995 se aisló C. pneumoniae de una lesión aterosclerótica coronaria (17). Sin embargo, no se ha establecido con clariadad si la bacteria causa daño directo en las arterias o este es mediado por mecanismos inmunológicos humorales o celulares. Para determinar si la infección crónica tiene un papel importante en la iniciación o progresión de la enfermedad, se han realizado ensayos clínicos de tratamiento con antibióticos para prevenir o mejorar las enfermedades ateroscleróticas (18-20) y se han desarrollado modelos animales de infección por C. pneumoniae (21-23). Un informe reciente proporciona evidencia experimental de mimetismo molecular entre antígenos bacterianos y proteínas específicas cardíacas, e indica que la respuesta inmunológica que genera la bacteria puede inducir linfocitos T autorreactivos contra tejido cardíaco (24). Por otro lado, se ha sugerido que la lipoproteína de baja densidad oxidada (oxLDL) es un autoantígeno que induce fuertes respuestas locales de linfocitos T en la placa y que la infección con C. pneumoniae activa las señales intracelulares proliferativas y estimula el crecimiento celular. No obstante, es necesario mejorar la caracterización de éste y otros antígenos, que pudiesen estar relacionados con procesos de inflamación-arterosclerosis, autoinmunidad o destrucción del tejido cardiaco (25,26). También existe un grupo de proteínas candidatas que pueden participar en este proceso de «mimetismo molecular»; son las proteínas inducidas por estrés, colectivamente conocidas como proteínas de choque térmico ( heat shock protein , HSP). Estas HSP se expresan o secretan por varios patógenos, principalmente C. pneumoniae y H. pylori , pero son también elaboradas por células vasculares de mamíferos expuestas al estrés asociado con daño por reperfusión o hipertensión aguda. Las HSP también se expresan por células dentro de las placas ateroscleróticas. Se ha informado que los títulos séricos de anticuerpos anti-HSP están relacionados positivamente con el riesgo futuro de enfermedad cardiaca coronaria. Además, dichos anticuerpos reconocen y median la lisis in vitro de células endoteliales y macrófagos humanos estresados (27,28). Estos datos involucran a C. pneumoniae como mediador patogénico y blanco terapéutico potencial en la prevención de enfermedad aterosclerótica (29). No se ha establecido, sin embargo, si existe algun patrón étnico o geográfico en el riesgo de ECV asociado a la infección por Chlamydophila .Es posible poner en evidencia la infección por C. pneumoniae mediante aislamiento del microorganismo, PCR y serología (30,31). Sin embargo, tanto el cultivo celular como la amplificación de ácidos nucleicos por PCR no son accesibles a los laboratorios de rutina. Por lo tanto, la serología es la herramienta más frecuentemente aplicada para el diagnóstico. El «estándar de oro» en serología de C. pneumoniae hasta el momento es la prueba de microinmunofluorescencia (MIF) (32-34).Para establecer si el antecedente de infección por Chlamydophila constituye un factor de riesgo en pacientes con ECV de nuestro medio, en el presente estudio se utilizó una prueba de MIF disponible comercialmente. Participaron pacientes con ECV de diverso grado de gravedad, que fueron pareados por edad y sexo con testigos sanos; se calculó la OR para determinar la fuerza de asociación entre ambas variables.

Diseño del estudio y pacientes
Se estudiaron pacientes atendidos en el Servicio de Cirugía de Corazón y Asistencia Circulatoria del CMN «La Raza», el cual atiende una población de 110 pacientes anuales. Los criterios de inclusión para el estudio fueron: pacientes con enfermedad del sistema cardiovascular, de ambos sexos y mayores de 30 años. El grupo fue representativo de una población de alto riesgo, se seleccionaron al azar 70 pacientes hospitalizados. El tamaño de muestra se estimó para muestras aleatorias simples, considerando una frecuencia de anticuerpos esperada de 50% y el peor resultado de 40%, con un intervalo de confianza del 99% (35). Los pacientes se estratificaron en tres grupos según el diagnóstico: 21 (30%) con angor, 19 (27%) con cardiopatía isquémica, y 30 (42.8%) con infarto agudo de miocardio (IAM) (figura 1A). Estos pacientes formaron el grupo de casos. El grupo testigo estuvo formado por 140 pacientes de ambos sexos, mayores de 30 años, pareados por edad y sexo con la población en estudio (dos testigos por cada paciente) y sin riesgo de ECV (figura 1B). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado después de recibir información oral y escrita. El presente estudio se revisó y autorizó por el comité de ética del Hospital de Infectología «Dr. Daniel Méndez Hernández» con el No. 17170599.

Análisis serológico
El análisis de los anticuerpos contra Chlamydia se realizó mediante técnica de MIF indirecta, de acuerdo a las recomendaciones del productor. Brevemente, los sueros se diluyeron al doble en PBS, pH 7.4, (desde 1:16 hasta 1:512) para anticuerpos de tipo IgG y 1:16 para IgM, sobre antígeno en laminillas que contenían preparaciones de cuerpos elementales de C. psittaci , C. pneumoniae y C. trachomatis . Se agregaron 10 µl de cada dilución en los pozos de reacción. Para IgM se incubó a 37 °C/180 min y para IgG a 37 °C/30 min; se lavó y se agregaron los respectivos conjugados con isotiocianato de fluoresceína para evidenciar los anticuerpos contenidos en las diluciones, utilizándose como colorante de contraste azul de Evans durante 30 min a 37 °C. Las laminillas se leyeron en un microscopio UV Olympus, con un lente de inmersión de 100X y un lente ocular de 10X (aumento total 1000X). Todas las laminillas se leyeron por el mismo investigador, quien desconocía la referencia de los sueros o cualquier característica clínica de los pacientes. El título final hacia cada antígeno se consideró como la dilución del suero más alta que demostró fluorescencia definida. El título de anticuerpos se expresó como el recíproco de la dilución del suero. El recíproco del título de IgG de ≥16 se usó como el límite inferior para serología positiva (36,37). También se ensayó la reacción cruzada con C. psittaci y C. trachomatis ; en este caso, los títulos de IgG de 64 o mayores se consideraron como positivos (38).

Análisis estadístico
Se utilizó la distribución normal, pero modificada en virtud de que el análisis de los resultados está en función de un factor de dilución, por lo que el análisis estadístico fue el de la distribución normal adaptado a logaritmos en base 2, por el factor de dilución empleado (39). Los resultados obtenidos se contrastaron con la t de Student para muestras independientes. Asimismo se calcularon los intervalos de confianza del 95% (IC 95%) en ambas poblaciones, testigo y de estudio. Para establecer la diferencia entre las proporciones de los títulos se utilizó χ². Se calculó la OR para grupos pareados a IC 95%.

Resultados
Con el propósito de investigar si la seropositividad contra Chlamydophila constituye un factor de riesgo para enfermedad cardiovascular en individuos mexicanos, se estudiaron 70 pacientes del servicio de Cirugía de Corazón y Asistencia Circulatoria del CMN «La Raza» que tuvieran diagnóstico de enfermedad cardiovascular fundamentado por electrocardiograma y ecocardiograma. Veintiún pacientes (30%) cursaban con angor, 19 (27%) con cardiopatía isquémica y 30 (43%) con IAM (figura 1A). Cuarenta y siete (67.1%) de los pacientes eran de sexo masculino y 23 (32.9%) de sexo femenino; la edad fluctuó entre 30 y 70 años, y la mayoría (19/70, 27.1%) se encontraba en el grupo de los 50 a 59 años (figura 1B).

Figura 1. Composición de la muestra. A. Distribución de pacientes con enfermedad cardiovascular según diagnóstico. B. Distribución de pacientes y testigos sanos según grupos de edad y sexo.

Cada paciente fue pareado con dos testigos sanos de la misma edad y sexo (figura 1B), y en ambos grupos se determinaron anticuerpos IgG contra C. psittaci , C. trachomatis y C. pneumoniae por el método de MIF indirecta, según las recomendaciones del productor, realizando las diluciones 1:16, 1:64, 1:256 y 1:512 y se consideró la dilución 1:16 como el punto de corte para clasificar a un individuo como positivo. Solo una persona sana presentó anticuerpos contra C. psittaci y 6 contra C. trachomatis . Ninguna persona con ECV presentó anticuerpos contra estas especies (40). El comportamiento fue muy diferente para C. pneumoniae, el 94.3% (66/70) de los pacientes presentó títulos, en contraste con el 37% (52/140) de los individuos sanos. Consecuentemente, este punto de corte diferencia a los pacientes y sus testigos con sensibilidad de 94.3% y especificidad de 62.9%; el valor predictivo positivo (VPP) fue de 55.9 %, el valor predictivo negativo (VPN) de 95.7%, y el riesgo relativo, estimado a través de la OR fue de 27.9 (9.6-81) (figura 2).

Figura 2. Determinación de anticuerpos contra Chlamydia . Distribución del título de anticuerpos contra C. pneumoniae en pacientes con enfermedad cardiovascular y sus testigos sanos.

La figura 2 presenta la distribución porcentual de los pacientes y sus testigos de acuerdo a la dilución máxima en la que se demostraron anticuerpos IgG contra C. pneumoniae . Sólo 4 pacientes de los 70 estudiados (5.7%) no presentaron anticuerpos contra C. pneumoniae, en contraste con 88 personas sanas de 140 (62.8%) incluidas en el grupo testigo. La mayoría de pacientes (31 de 70, 44.3%) presentaron un título de 1:64. En la figura 3 se presentan los títulos de anticuerpos de acuerdo al sexo. Se observa que las mujeres (figura 3A) tienen títulos más bajos que los hombres (figura 3B).

Figura 3. Títulos de anticuerpos contra C. pneumoniae de acuerdo al sexo. A. Titulo de anticuerpos en mujeres. B. Título de anticuerpos en hombres.

Trece pacientes del sexo masculino presentaron título de 1:512 en tanto que sólo una mujer presentó este título (p 0.001). Seis mujeres tuvieron un título 1:16 en comparación con 4 hombres que presentaron el mismo título. En cambio, el comportamiento de los títulos en hombres y mujeres en el grupo de personas sanas no tuvo diferencias significativas (figura 3). Considerando como punto de corte la dilución 1:16, la OR en hombres fue de 36.3 (8 a 162) y en mujeres de 19.7 (4 a 94.8). Las tablas en los recuadros de la figura 3 presentan la clasificación de los individuos como positivos o negativos, cuando el punto de corte es la dilución 1:16. Este corte diferencia a los grupos de pacientes y testigos del sexo masculino con sensibilidad de 55.7%, especificidad de 61.70%, VPP de 95.7% y VPN del 61.7%. Estas cifras no fueron significativamente diferentes en las personas del sexo femenino, pues en ellas se encontró sensibilidad de 56.8%, especificidad de 65.2%, VPP 91.3 % y VPN 65.3%. Sin embargo, la OR fue mayor en las personas del sexo masculino: 36.3 (8 - 162) contra 19.7 (4 - 94.8).Se observó que, en general, los títulos fueron menores en el grupo testigo que en el grupo de pacientes, el cual presentó gran dispersión debido a que se consideraron, para este análisis, con título cero a los pacientes que no tenían anticuerpos. Por ello, no fue posible calcular la media geométrica (xg) en todo el conjunto. Sin embargo, al calcular la media geométrica de los títulos considerando sólo a los individuos con títulos positivos, se observó que en los pacientes el título se incrementó conforme aumentó la edad, excepto para el grupo de mayores de 75 años (40). En contraste, la media geométrica en los testigos sanos disminuye gradualmente conforme la edad aumenta (figura 4).

Figura 4. Distribución del título de anticuerpos contra C. pneumoniae según edad. Títulos de anticuerpos según grupos de edad (números absolutos).

Estos datos, como se explica más adelante, son congruentes con la observación de que la OR se incrementa con la edad (figura 5A).

Figura 5. Estimación del riesgo relativo (mediante odds ratio, OR) de poseer anticuerpos contra C. pneumoniae correspondiente a pacientes con enfermedad cardiovascular. A. OR de acuerdo a la edad cuando se considera como positivo a un individuo con título ≥ 64. B. OR de acuerdo al sexo cuando se considera como positivo a un individuo con título ≥ 64.

En la figura 5 se presenta la OR de acuerdo con la edad cuando se considera como positivo a un individuo con título 1:64 o mayor. Puede observarse que el riesgo es mayor conforme la edad aumenta, a pesar de que en el grupo de 60 a 69 años se observó disminución de la OR (figura 5A). La asociación entre anticuerpos contra Chlamydophila y ECV fue mayor en personas del sexo masculino y se incrementa con la edad (figura 5B). Por último, se comparó el título de anticuerpos IgG contra Chlamydophila pneumoniae en los pacientes de acuerdo al diagnóstico. La mayoría de los pacientes presentó títulos 1:64, independientemente del diagnóstico (angor 38.1%, cardiopatía isquémica 47.4% e infarto 46.7%) (40). Sin embargo, al calcular la OR según el tipo de padecimiento cardiovascular, se observa que éste es mayor conforme la gravedad del trastorno cardiovascular se incrementa. Los pacientes con angor tuvieron OR de 16.1 (9.4 - 26.9); los pacientes con cardiopatía isquémica, de 30.5 (4 - 235.6); y los pacientes con IAM, de 49 (6.5 - 369) (figura 6).

Figura 6. OR según el tipo de padecimiento cardiovascular.

Discusión
Existen numerosas evidencias que vinculan las enfermedades cardiovasculares, específicamente el desarrollo de aterosclerosis, con la presencia de anticuerpos contra C. pneumoniae. Recientemente, se han logrado establecer algunos posibles mecanismos patogénicos por medio de los cuales esta bacteria sería capaz de desencadenar el proceso de aterosclerosis y daño cardiaco. Se ha comprobado que la respuesta inmunológica del hospedero puede iniciar la cascada de eventos que lleva a daño, pues en modelos murinos la infección con la bacteria estimula a linfocitos T CD4+ que reconocen al péptido de la cadena pesada de miosina α específica de músculo cardíaco, y que son autorreactivos contra tejido cardíaco debido a mimetismo antigénico. Se ha postulado que es muy posible que fenómenos semejantes sucedan en el ser humano. Aunque algunos estudios epidemiológicos todavía confieren información contradictoria, la mayoría de ellos apoya la asociación entre anticuerpos contra Chlamydophila y ECV. No se ha ponderado, sin embargo, si existe alguna diferencia de tipo étnico o geográfica que influya sobre el desarrollo de la respuesta inmune autorreactiva. En nuestro país existe poca información sobre la asociación entre ECV y anticuerpos contra Chlamydophila . En un estudio realizado en México se determinó, por medio de inmunofluorescencia directa, la presencia de antígenos bacterianos en lesiones aterosclerosas de aorta (41); y en otro estudio, que incluyó 30 pacientes con ECV aguda o crónica, se demostraron anticuerpos contra la bacteria en 50% de los pacientes con enfermedad aguda y en 25% de aquellos con ECV crónica (42). Estos estudios, sin embargo carecen de grupos testigo, por lo que no es posible establecer la fuerza de la asociación o riesgo entre ECV y anticuerpos contra Chlamydia .Para solucionar este problema se diseñó un estudio de casos y testigos. El grupo de casos se constituyó a partir de 70 pacientes provenientes del Servicio de Cirugía de Corazón y Asistencia Circulatoria del CMN «La Raza», que incluyó 21 con angor, 19 con cardiopatía isquémica y 30 con IAM. La clasificación de los pacientes se realizó de acuerdo con los criterios de evaluación clínica, por electrocardiograma y ecocardiograma. Cada paciente fue pareado, de acuerdo a edad y sexo, con dos testigos sanos y sin factores de riesgo para ECV. En ambos grupos se determinaron anticuerpos séricos IgM e IgG contra Chlamydia trachomatis , Chlamydophila psittaci y pneumoniae . En ninguna persona fue posible demostrar anticuerpos IgM contra ninguna de las tres especies, lo que sugiere que ninguno cursaba con infecciones recientes por esta bacteria. Sólo en siete personas se demostraron anticuerpos contra Chlamydia no- pneumoniae , todos ellos pertenecientes al grupo de testigos sanos (40). Al considerar un título 1:16 o mayor como punto de corte para calificar a un individuo con anticuerpos IgG contra C. pneumoniae, se demostró que el 94.3% de la población de pacientes con ECV fue positivo, en comparación con el 37% de la población testigo (6,43,44). Este punto de corte diferenció a los grupos de casos y testigos con sensibilidad de 94.3%, especificidad de 62.9%, VPP de 55.9% y VPN de 95.7%. Se observó en los pacientes hombres tendencia a tener títulos de anticuerpos más altos que en las mujeres. Al estimar de manera indirecta el riesgo relativo mediante la OR, se encontró riesgo mayor en hombres (36.3 vs . 19.7), que se incrementa con la edad. Esta fuerza de asociación es mayor en los hombres conforme aumenta su edad, en concordancia con lo informado en la literatura (37). Fue muy interesante comprobar que el riesgo es mayor conforme la gravedad de la ECV se incrementa; así, la OR fue de 16.1 para angor, de 30.5 en cardiopatía isquémica y de 49.1 en IAM.El hecho de encontrar que el 37% del grupo testigo tiene anticuerpos IgG contra C. pneumoniae sugiere que la prevalencia en la población general debe ser alta y que por tanto en una proporción de pacientes, Chlamydophila es un factor desencadenante de ECV; en este grupo de personas susceptibles la infección se comporta como un factor casual necesario, pero no suficiente. La susceptibilidad debe estar determinada por factores inherentes al hospedero y atribuibles a la bacteria, la propensión de montar una respuesta inmune autorreactiva pudiese estar limitada a algunos haplotipos del MHC de clase II. Por otro lado, es muy probable que existan diferencias en la virulencia de C. pneumoniae (45). Se ha demostrado variación antigénica en este microorganismo y, por lo tanto, se podría especular que diferentes genotipos de C. pneumoniae pueden estar asociados con diferentes síndromes clínicos, tales como infecciones del tracto respiratorio o aterosclerosis (46-48). Los valores estadísticos encontrados para la población testigo fueron: xg, 32.4 ± 8.48; s = 4.24; IC 95%, 23.9 - 41.3; y para la población de pacientes: xg, 87.4 ± 6.48; s = 3.24; IC 95%, 80.9 - 93.9. El presente estudio reveló una fuerza de asociación o riesgo muy importante entre enfermedad cardiovascular y seropositividad para IgG contra C. pneumoniae; en especial, el mayor riesgo fue con IAM. Los estudios retrospectivos, sin embargo, no permiten establecer la prevalencia de anticuerpos en la población general y por tanto estimar el verdadero riesgo relativo. Es necesario establecer si existe infección crónica y presencia de la bacteria en las placas ateromatosas, pues la determinación de anticuerpos no implica la existencia de infección activa o el órgano blanco donde se desarrolla ésta. Es también indispensable determinar que proporción de pacientes cursan con linfocitos autorreactivos que reconozcan mimotopos de C. pneumoniae.