ANALISIS DE PROTEINAS URINARIAS EN EL LABORATORIO CLINICO

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RESUMEN

El análisis de proteínas urinarias en el laboratorio clínico suele consistir de un primer estudio por electroforesis simple sobre orina concentrada (EFU), seguido de la identificación de las paraproteínas sospechosas por electroforesis de inmunifijación (EIF). En este artículo se describen los patrones anormales de EFU que permiten definir la localización de la patología renal. También se muestra cómo pueden utilizarse los patrones peculiares de EFU y EIF para suplementarse entre sí en la identificación de proteínas de Bence Jones sin necesidad de repetir análisis. Además, se presenta una forma de utilizar la nefelometría automatizada sobre orina no concentrada para reducir la cantidad de los tediosos ensayos de EIF. ABSTRACT

Urine protein analysis in the clinical laboratory usually consists of screening by stand alone electrophoresis (UPE) on concentrated urine followed by identification of suspect paraproteins by immunofixation electrophoresis (IFE). Here I outline abnormal patterns on UPE defining sites of kidney disease. I also show how peculiar patterns on UPE and IFE can be used to supplement one another to achieve identification of Bence Jones proteins without need for repeat analysis. Besides, I present a way that automated nephelometry on unconcentrated urine can be used to help reduce the amount of more tedious IFE. PROPOSITO DE LA ELECTROFORESIS URINARIA (EFU)

La EFU tiene 2 objetivos.

El primero es determinar si la proteinuria se debe a enfermedad tubular, glomerular o mixta
El segundo es identificar proteínas plasmáticas específicas que han sido excretadas por orina. Usualmente se trata de cadenas livianas libres de las inmunoglobulinas (denominadas proteínas de Bence Jones [PBJ]), pero la identificación de lisozima puede ser también útil para el diagnóstico de la leucemia mieloide aguda [1,2].

IDENTIFICACION DE LA LOCALIZACION DE LA ENFERMEDAD RENAL

Como se muestra en la figura 1, el perfil proteico en la EFU permite determinar cuál es la región renal afectada, cumpliendo fácilmente el primer objetivo. La pérdida proteica de origen tubular aparece como una banda tenue de albúmina y una región densa de gamaglobulinas. La proteinuria de origen glomerular presenta una banda muy densa de albúmina con una región gamaglobulina mucho más tenue. La proteinuria mixta (origen tubular y glomerular) aparece como una banda densa de albúmina y una región gamaglobulina también densa. Es posible observar una PBJ superpuesta sobre cualquiera de estos patrones o migrando sola en la región beta o gamma sin otras proteínas aparentes, aunque por lo general se observa también algo de albúmina. Este último caso se muestra en la figura 1 como proteinuria de sobreflujo. (INSERTAR LA FIGURA 1)Figura 1. Tipos de proteinuria. La descripción de cada tipo se indica en el texto. El sobreflujo ilustra una paraproteína (en este caso una proteína de Bence-Jones o PBJ) migrando en la región beta, superpuesta sobre un patrón levemente glomerular. El sobreflujo implica que hay tanto PBJ que sobrepasa la capacidad natural del riñón de reabsorber proteína, por lo que se pierde por orina. La migración es hacia el electrodo positivo. IDENTIFICACION DE PBJ

El segundo objetivo de la EFU es mucho más difícil de alcanzar por 3 razones:

Dado que las proteínas monoclonales son peculiares, las halladas en distintas muestras de orina de un mismo paciente no migran siempre en el mismo lugar de la EFU. Por lo tanto, la electroforesis permite identificar sólo presuntivamente una PBJ. Habitualmente se describe a una banda inusual como una paraproteína (posible PBJ)
La EFU no es lo suficientemente sensible para detectar niveles muy bajos de PBJ
Cuando la proteinuria es importante, la PBJ puede estar enmascarada por otras bandas proteicas

Por todas estas razones, la identificación definitiva de PBJ requiere del auxilio de una técnica inmunológica. La técnica más sensible y más comúnmente utilizada es la electroforesis de inmunofijación (EIF). Este procedimiento tiene también la ventaja de ser unas 5 veces más sensible que la EFU para detectar proteínas [3,4]. Pueden utilizarse 2 tipos de antisueros para identificar PBJ. Los sueros contra cadenas livianas libres y unidas reaccionan con la PBJ y con cadenas ligadas a inmunoglobulinas intactas, mientras que los sueros específicos contra cadenas livianas libres sólo reaccionan con la PBJ. La EIF es mucho más tediosa y costosa que la EFU, lo cual justifica desde el punto de vista económico utilizar a esta última para la detección de casos (screening). Estas relaciones suponen una serie de problemas para el operador. Para detectar niveles muy bajos de PBJ se recomienda concentrar la orina entre 100 y 150 veces antes de realizar la EFU o la EIF [3,5]. La dificultad con este procedimiento es que mientras las PBJ que estaban en pequeña cantidad se tornan más visibles, las PBJ originalmente abundantes pueden volverse tan densas que adquieren una apariencia policlonal en la EFU, o pueden reaccionar débilmente en la EIF debido al exceso de antígeno (dando una imagen de rosquillas en lugar de bandas). En algunos casos, inclusive, el exceso de antígeno produce imágenes ovales grandes en las que sólo se tiñe el anillo exterior (figura 2). (INSERTAR LA FIGURA 2)Figura 2. Aspectos peculiares por exceso de antígeno en la electroforesis urinaria (EFU) y la electroforesis de inmunofijación (EIF). La paraproteína (PBJ) es tan densa en la EFU que podría parecer policlonal. La EIF indica que se trata de una PBJ de cadena . La distorsión del bandeo se reduce con la dilución hasta que se observa una banda diferenciada. Los antisueros usados para fijación se indican por la clase de inmunoglobulina (G, A, M, , ). L&U indica que el suero es contra cadenas livianas totales (libres y unidas), mientras que L indica suero contra cadenas libres. Los círculos en la base del gel son controles de antisuero. La migración es hacia abajo. La concentración 100X o 150X suele considerarse suficiente para detectar e identificar por EIF todas las PBJ en bajo nivel, pero aun este nivel de concentración resulta insuficiente para la EFU, menos sensible. Este problema se ilustra en la figura 3, donde no se observan bandas de PBJ con la EFU pero sí con la EIF. (INSERTAR LA FIGURA 3)Figura 3. Aumento de la sensibilidad con la EIF. El ensayo con suero contra cadena kappa libre y unida () y contra cadena kappa libre (L) muestra sólo una banda, mientras que la EFU no revela ninguna banda. Los símbolos restantes son iguales a los usados en la figura 2. En nuestro laboratorio se reducen los costos asociados a la realización de la EIF mediante las siguientes estrategias:

En primer lugar, todas las orinas se concentran entre 80 y 100 veces con un concentrador mecánico de filtración estacionaria; hemos podido alcanzar fácilmente ese nivel de concentración utilizando un concentrador de ultrafiltración centrífuga
En segundo lugar, se realiza EFU sobre las muestras concentradas
Finalmente, ensayamos la relación kappa/lambda (/) en la orina no concentrada usando inmunonefelometría automatizada y realizamos EIF sólo en caso necesario, como se describió previamente [6]. La tabla 1 muestra el algoritmo que empleamos.

(INSERTAR LA TABLA 1)En nuestra experiencia con cientos de muestras nunca hemos visto una relación / entre 1 y 2.5 o una concentración de cadena menor a 18.5 mg/l y una concentración de cadena menor a 50 mg/l con una PBJ, pero si vemos una banda peculiar de todas maneras corremos una EIF. En esos casos ensayamos sólo y por EIF y esperamos hasta que la placa esté totalmente llena. Esta estrategia elimina casi el 40% de las EIF urinarias y reduce la mayoría del resto sólo al análisis de y . En el caso de que veamos una banda monoclonal o una banda o peculiar en esta EIF abreviada en la que sólo se ensayan las cadenas livianas, repetimos la EIF usando sueros contra IgG, IgA, IgM, y totales (libres y unidas) y cadenas livianas libres. El ensayo de IgM no es obligatorio ya que por lo general es demasiado grande para atravesar el glomérulo y aparecer en orina. Sólo la ensayamos cuando existen lugares vacantes en la placa o se justifica por alguna razón (IgM monoclonal en el suero, por ejemplo). No repetimos la EFU sobre la placa de EIF, pero comparamos el perfil de EIF con la imagen de la EFU [7]. Un bandeo extremadamente distorsionado sobre la EIF es identificado como PBJ por comparación con la EFU, que frecuentemente muestra una banda. Como se muestra en la figura 3, aun si la banda en la EFU es tan densa que parece policlonal, la banda distorsionada en la EIF indica que es monoclonal. Raramente es necesario diluir las muestras para repetir el ensayo. Si existe una proteína monoclonal intacta junto con una PBJ, aunque podrían superponerse, la tinción con anti- o anti- será usualmente mucho más intensa, por lo que normalmente no se requiere dilución y repetición para identificar 2 bandas distintas que migran cercanamente. Por otra parte, si el suero contra cadenas livianas libres muestra una banda se trata en apariencia de una PBJ. Estos conceptos se ilustran en la figura 2, donde una IgG cadena intacta migra catódicamente respecto de una gran PBJ. La IgG intacta parece tenue cuando se tiñe con suero anti-IgG. A una concentración de 100X de la orina se produce un efecto prozona por el gran exceso de antígeno cuando se tiñe con suero contra cadena libre y unida. Esto indica que la muestra contiene mucha más PBJ que IgG intacta. La observación cuidadosa muestra que el centro del efecto prozona migra levemente en el frente de la banda correspondiente a la IgG intacta. En este caso no hay necesidad de repetir la prueba con dilución de la orina; en el ejemplo se diluyó la orina para demostrar que puede obtenerse una banda diferenciada. En caso de que se observe una proteína monoclonal intacta sin PBJ, el suero contra cadenas livianas libres es útil para llegar a la interpretación correcta. En este caso, hacemos una serie de diluciones y luego fijamos con sueros contra cadena pesada, contra cadenas livianas totales y contra cadenas livianas libres [5,8]. La tira fijada con suero contra cadenas livianas totales debería mostrar una banda coincidente con la banda de cadena pesada, pero la tira fijada con suero contra cadenas livianas libres no debería mostrar ninguna banda. Es importante recordar que el suero contra cadenas livianas libres siempre tiene menos avidez que el suero contra cadenas livianas totales y puede dar un efecto de prozona tan extenso que no se vea ninguna reacción. Este efecto puede verse en la figura 2 con el concentrado 100X. Por esta razón corremos las muestras a varias diluciones cuando usamos suero contra cadenas livianas libres. También es importante asegurarse de que este suero no esté reaccionando con las cadenas livianas unidas. Esto se comprueba fácilmente ensayando un suero normal con el suero contra cadenas livianas libres antes de utilizarlo con las muestras de orina; no debería observarse reacción alguna. Aunque muchos laboratorios ensayan si el suero contra cadenas livianas libres reacciona con cadenas libres conocidas, nosotros no lo hacemos porque esa propiedad es fácilmente evaluada en la práctica con la orina de un paciente real. PATRON DE BANDAS MULTIPLES

Otro problema que puede presentarse al ensayar la orina por EIF es la aparición de un patrón de bandas en escalera [9,10]. Este patrón consiste en 3 a 7 bandas difusas, con frecuencia de tipo kappa pero también de tipo lambda, superpuestas a una región de tinción difusa. Aunque este patrón es en verdad policlonal, la aparición de este bandeo puede ser interpretada como una serie de proteínas monoclonales. El patrón resulta especialmente confuso para el observador no experimentado dado que la segunda banda o la banda del medio suele aparecer más oscura que las otras y puede interpretarse como monoclonal. Este bandeo suele verse en los pacientes con proteinuria aumentada, pero puede verse también en la orina normal cuando se halla muy concentrada. Por ello, es desaconsejable concentrar la orina más de 150X [11]. BIBLIOGRAFIA

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