MICROORGANISMOS TERMOFILOS DEL AMBIENTE AZUCARERO DE JUJUY, ARGENTINA

Artículo completo
³RESUMEN

Se aislaron actinomicetos y bacterias esporuladas aerobias de 27 muestras de caña de azúcar verde, caña cortada, restos en el campo, polvo suspendido en el aire, barros de filtración y compuestos. Se identificaron 28 cepas de Thermoactinomyces (T. sacchari 26, T. dichotomicus 2), 1 de Saccharomonospora viridis, 30 de Streptomyces spp. y 25 de Bacillus spp. Se comprobó en el aire próximo a un depósito de bagazo la presencia de 100 ufc Bacillus /m³, 500 ufc Streptomyces /m³ y 700 ufc Thermoactinomyces /m³. Los restos de caña abandonados en los campos constituyen una importante fuente de actinomicetos porque el clima permite el crecimiento de los termófilos y el viento distribuye los esporos. T. sacchari, Sacch. viridis y algunos Streptomyces son responsables de alveolitis alérgica. Las pruebas de inmunodifusión mostraron en seis sueros la precipitación de anticuerpos frente a un antígeno de T. sacchari, sobre un grupo de 114 trabajadores. Palabras clave: actinomicetos, alveolitis alérgica, esporos termófilos, caña de azúcar, Thermoactinomyces. SUMMARY

Actinomycetes and endospore-forming bacilli were isolated from 27 samples of green sugar cane, cane stalk, air dust, cane wastes, juice filtration mud, and composts. Twenty eight Thermoactinomyces strains (T. sacchari 28, T. dichotomicus 2), one Saccharomonospora viridis strain, thirty Streptomyces atrains and twenty five Bacillus strains were identified. Air dust near a bagasse pile contained 100 cfu Bacillus /m³, 500 cfu Streptomyces /m³ and 700 cfu Thermoactinomyces /m³. Field cane wastes are actinomycete sources because climate allows thermophilic growth and spores are spread by the wind. The T. sacchari, Sacch. viridis and some Streptomyces can produce allergic alveolitis. Six positive immunodiffusion tests from 114 workers were positive. Key words: actinomycetes, allergic alveolitis, thermophilic spores, sugar cane, Thermoactinomyces. INTRODUCCIÓN

En las zonas subtropicales, con clima continental de grandes amplitudes diarias, suelen proliferar los microorganismos termófilos o termotolerantes. Por este motivo se inició hace algunos años el estudio de estos organismos en el ambiente azucarero de la provincia de Jujuy (Argentina), donde la temperatura máxima absoluta supera los 43 ºC de octubre a marzo y la media es mayor a 30 ºC, mientras que la temperatura mínima media está por sobre los 18 ºC en igual período.¹ Los microorganismos procarióticos esporulados aerobios, termófilos o termotolerantes, que se encuentran en el material vegetal pertenecen a tres grupos:

los bacilares que forman endosporos
los filamentosos que generan esporos aislados
los que forman cadenas por subdivisión del filamento

Se aislaron cepas de estos organismos a partir de diversos materiales y se identificaron por estudios morfofisiológicos. Además, se analizó la inmunidad humoral de algunos trabajadores frente al antígeno de Thermoactinomyces sacchari, una especie conocida como agente de alveolitis alérgica. MATERIALES Y MÉTODOS

Se trabajó con las siguientes muestras tomadas hacia fines de la zafra: 2 de tallos y hojas de caña de azúcar verde, 2 de cañas chamuscadas colocadas en los transportes, 8 de restos de caña y hojas en el campo, 3 del polvo suspendido en el aire tomadas con un impactador de Porton conectado a una bomba portátil próximo a un depósito de bagazo, 2 de barros de la filtración del jugo azucarado, y 10 de compuestos preparados en distinto tiempo con hojas de caña y barros de filtración. Dado que el bagazo se emplea para la producción de papel en un ingenio y con fines energéticos en los demás, no se pudo contar con muestras.Se emplearon los siguientes medios de cultivo: agar malta y levadura, agar nutritivo de media concentración,² agar nutritivo levadura. Se sembraron las placas con las suspensiones de polvo ambiental captado en la solución de Ringer diluida al cuarto del impactador² y las suspensiones 1/10 de los materiales sólidos en la misma solución o en agua estéril, obtenidas por agitación enérgica. Las cajas fueron incubadas a 50 ºC durante 3 a 7 días en un ambiente húmedo, pero durante el aislamiento de los actinomicetos polisporados algunas fueron colocadas a 45 ºC. Se hicieron observaciones microscópicas en fresco y coloreadas, según los métodos de Gram y de Wirtz para endosporos,³ a fin de apreciar los tres grupos de organismos.Para la identificación de los actinomicetos se determinó: el crecimiento entre 30 y 60 ºC; las características macroscópicas sobre agar avena,² agar almidón sales y agar asparagina glicerol; la degradación de almidón, caseína, esculina, gelatina, lecitina, tirosina y xantina; la utilización de L-arabinosa, celobiosa, D-fructosa, glicerol, D-galactosa, D-glucosa, m-inositol, lactosa, maltosa, manitol, rafinosa, salicina, sacarosa, D-xilosa,4,5 Na citrato y L-fenilalanina; la reducción de nitratos y la producción de H2S. También se hicieron cultivos en presencia de compuestos inhibidores (fenol 0,1%, Na azida 0,01%, NaCl 7% p/v) o antibióticos (colistina, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, novobiocina, penicilina G, rifampicina, tetraciclina, vancomicina).⁵ Para el estudio de los bacilos se observó: el crecimiento entre 30 y 65 ºC; el desarrollo en condiciones de anaerobiosis y en medios de pH 4 y 5; la acción de inhibidores (Na azida 0,02%, NaCl 7% y 10%, sacarosa 50% p/v); la hidrólisis de almidón y caseína; la reducción de nitrato; la utilización de citrato y propionato; la prueba de Voges-Proskauer y la producción de ácido a partir de L-arabinosa, D-celobiosa, glicerol y D-xilosa.^6,7Se empleó el procedimiento de doble diálisis de Edwards⁸ para la preparación del antígeno metabólico de Thermoactinomyces sacchari. Se lo empleó concentrado diez veces por diálisis frente a PVP en los ensayos de inmunodifusión en gel de agar al 1,5% p/v en solución reguladora de fosfatos pH 7,4.⁹ Los sueros se colocaron en frascos que contenían 1 mg de tiomersal para su conservación. Después de cargar los pocillos, las placas se dejaron en el refrigerador a 10 ºC hasta 7 días, al cabo de los cuales se lavó durante 24 hs con solución de citrato de sodio al 1% p/v. Los resultados se registraron como el número de arcos de precipitación. RESULTADOS

Se aislaron del ambiente cañero de Jujuy, 29 cepas de actinomicetos monosporados (Thermoactinomyces sacchari 26, T. dichotomicus 2, Saccharomonospora viridis 1), 30 cepas de actinomicetos polisporados distribuidas entre siete especies de Streptomyces y 25 cepas de Bacillus correspondientes a cuatro especies (Streptomyces antibioticus 3, S. chromofuscus 14, S. cyaneus 1, S. halstedii 2, S. microflavus 6, S. sp. 1, S. violaceusniger 3, Bacillus coagulans 3, B. licheniformis 19, B. stearothermophilus 2, B. subtilis 1).La figura 1 resume los aislamientos hechos de los diversos materiales. En todos los casos se encontraron los tres tipos de organismos, pero no siempre se recuperaron las cepas. En los residuos invadidos por microorganismos en el campo también se observaron colonias con micromorfología de Actinomadura pero no fueron estudiadas.(INSERTAR LA FIGURA 1)Figura 1. Cepas de actinomicetos aisladas de diversos materiales.

Se comprobó la presencia de 100 ufc Bacillus /m³, 500 ufc Streptomyces /m³ y 700 ufc Thermoactinomyces /m³ en el polvo suspendido en el aire, tomado cerca de la zona de almacenamiento de bagazo de un ingenio en un día sin viento. Los restos de caña y hojas cortadas abandonados en los campos constituyeron una fuente importante de actinomicetos, porque la temperatura ambiente es suficientemente alta para el desarrollo de estos organismos. En algunos casos se observó que el polvillo blanco que recubría al material vegetal consistía en esporos de T. sacchari. También se obtuvieron cepas de Thermoactinomyces a partir de los compuestos preparados con barros de la filtración del jugo azucarado y hojas de caña.El estudio inmunológico se hizo sobre un grupo de 114 de trabajadores. Seis sueros presentaron líneas de inmunoprecipitación frente al antígeno de T. sacchari, dos dieron dos líneas y los otros cuatro solamente una. DISCUSIÓN

Las cepas de T. sacchari fueron primeramente identificadas como T. thalpophilus de acuerdo al manual de Bergey,⁴ pero actualmente es considerado un sinónimo.¹⁰ La quemazón de los campos parece mejorar el corte, la carga y el transporte de la caña. La superficie de los tallos puede llegar a estar a 400 ºC durante 3 segundos y esto bastaría para esterilizar la superficie, pero suele rajarse permitiendo el ingreso de microorganismos lo que conduce a un rápido deterioro si la caña no es procesada en corto tiempo.¹¹ Esta práctica origina un aerosol de material carbonoso que el viento arrastra por kilómetros.Los bacilos aerobios formadores de endosporos siempre se encuentran en los polvos orgánicos pero generalmente en bajo número.¹² Los Streptomyces termófilos y termotolerantes, junto con Thermoactinomyces y Saccharomonospora, se hallan en todos los materiales vegetales acumulados. Los actinomicetos contribuyen al proceso de compostado debido a su capacidad para degradar celulosa, lignocelulosa y lignina. Durante el compostado el crecimiento comienza cuando se alcanza la temperatura mínima necesaria y luego, debido que no hay posibilidad de enfriamiento, la temperatura sube hasta 65 ºC o más, mientras que el orden del número de esporos termófilos asciende de 10³ a 10⁷ ufc/g.¹³ Los esporos son liberados de la superficie del suelo o los vegetales por las ráfagas de viento o las gotas de lluvia. El orden del número de esporos en el aire de las áreas de compostado de residuos verdes, suele ser de 10⁴ ufc/m³, pero aumenta en el momento de la remoción.¹³ El relativamente bajo número de esporos de Thermoactinomyces que suele encontrarse parece estar relacionado a la necesidad de activación por el calor para germinar.¹⁴El tamaño de las partículas inhaladas determina el tipo y la localización de la reacción de hipersensibilidad en los pulmones. Los esporos de actinomicetos, con un diámetro menor que 1 m, logran alcanzar los alvéolos donde se depositan y son responsables de alveolitis alérgica, también llamada pneumonitis por hipersensiblilidad o pneumonitis granulomatosa.¹²La exposición continua a concentraciones microbianas mayores a 10⁵ ufc/m³ causan trastornos respiratorios en las personas y animales expuestos. Los esporos de los actinomicetos termófílos que contaminan los ambientes agrícolas estimulan las reacciones de los macrófagos pulmonares y conducen a la inflamación y lesión del tejido.¹⁴ CONCLUSION

La fuente más importante de los actinomicetos alergénicos del polvo suspendido en el aire proviene de los trozos vegetales remanentes en los campos, debido a las características climáticas. El viento distribuye los esporos y están expuestos todos los habitantes, porque los pueblos y ciudades están insertos en la zona de producción cañera. La exposición es conspicua porque algunos trabajadores presentaban serología positiva frente T. sacchari. BIBLIOGRAFIA

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