IMUNOPATOGENIA DA LEISHMANIOSE CANINA

Artículo completo
RESUMO

Com base na capacidade infecciosa das diferentes formas morfológicas de L. infantum (promastigotas de cultura ou amastigotas) foram estabelecidos dois modelos de infecção canina, modelo de infecção latente e modelo de infecção patente. O modelo experimental de infecção canina patente comporta-se de forma similar à doença natural, com fase assintomática e sintomática, disseminação do parasita pelos diferentes órgãos internos e pela pele com possibilidade da sua transmissão. O modelo de infecção canino latente mantém o parasita, provavelmente em pequeno número, sem evoluir para a doença, reproduzindo os cães portadores sãos existentes em áreas endémicas de leishmaniose. A imunopatogenia da infecção caracteriza-se por um período pré-patente relativamente longo, por uma resposta humoral bem marcada com níveis elevados de IgG2 associados à ocorrência de sintomatologia e por uma generalizada ausência de resposta celular específica. No entanto, a existência de animais infectados que apresentam respostas imunitárias celulares específicas, ainda que de forma inconstante, associada à variabilidade de expressão das manifestações clínicas sugere que outros factores intrínsecos ao hospedeiro, nomeadamente as características genéticas individuais do cada animal, influencia a evolução da infecção por L. infantum diversificando a apresentação clínica da leishmaniose canina. Palavras chave: Leishmania infantum, modelo canino, imunidade humoral e celular, IFN-y, IL-2, IL-10. SUMMARY

Two canine infection models, latent infection and patent infection, based on the infection capacity of different morphological stages of L. infantum (cultured promastigotes and amastigotes), were established. The patent experimental model of canine infection and the natural infection develop similar patterns, such as, asymptomatic and symptomatic phases, parasite dissemination through different internal organs and skin, leading to its possible transmission. The latent model of canine infection maintains the parasite, probably in small numbers, without provoking disease, being these dogs healthy parasite carriers in endemic areas of leishmaniasis. The immunepathogenecity of the infection is characterised by a relatively long pre-patent period, a pronounced humoral response, with high IgG2 levels, associated with the symptomatology and no specific cellular immune responses. However, the fact that infected animals present specific cellular immune responses, in spite of their inconsistency, is associated to the variability of clinical manifestations, suggesting that other host intrinsic factors (namely the individual genetic characteristics) influences the evolution of infection by L. infantum. This diversifies the clinical presentation of canine leishmaniasis. Key Words: Leishmania infantum, canine model, humoral and cellular immunity, IFN-y, IL-2, IL-10.SIGLAS

ELISA: Enzime-linked immunosorbent assay; PCR: Reacção em cadeia da polimerase; RT-PCR: Transcrição reversa da reacção em cadeia da polimerase; IFN: Interferão; IL: Interleucina; TNF: Factor de necrose tumoral.INTRODUÇÃO

A leishmaniose humana visceral, existente na China e nos países do sul da Europa ocidental, do Norte de África, do Médio Oriente, e da América do Sul, é uma zoonose causada por Leishmania infantum (indistinta de L. chagasi, [1]). O cão é o principal reservatório deste parasita e tem um papel fulcral na sua transmissão, através de um insecto vector pertencente à família Psycodidae (géneros Phlebotomus no velho Mundo e Lutzomyia no novo Mundo). A prevalência da infecção nos cães é elevada, pelo que em áreas endémicas a leishmaniose canina é simultaneamente um problema veterinário e de saúde publica.A apresentação clínica das leishmanioses e a sua evolução resulta de um complexo conjunto de interacções que se estabelecem entre e o parasita e o sistema imunitário do hospedeiro. A evolução da infecção depende, essencialmente da capacidade do macrófago em destruir o parasita. Esta actividade é determinada pelo estabelecimento de uma resposta imunitária celular eficaz que, por sua vez, se encontra dependente do equilíbrio que se estabelece entre as diferentes citocinas produzidas pelo hospedeiro. Embora exista informação abundante sobre a resposta imune na infecção por Leishmania em modelo murino, os conhecimentos sobre a imunopatogenia da leishmaniose canina são limitados. O cão tem sido considerado como um importante modelo para o estudo experimental das infecções causadas por L. infantum e L. chagasi, uma vez que permite aprofundar os conhecimentos da infecção natural em diversas vertentes, nomeadamente, nos estudos de eficácia de novos fármacos ou de protecção induzida por produtos candidatos a vacinas. No nosso laboratório foram estabelecidos dois modelos de inoculação de L. infantum em cães, reproduzindo a leishmaniose natural. Foram efectuados estudos imunopatogénicos da infecção causada por L. infantum nestes modelos. A evolução da infecção em animais experimental e naturalmente infectados foi comparada em relação ao aparecimento das manifestações clínicas, ao parasitismo e à resposta imunitária humoral e celular desenvolvidas pelo hospedeiro. MODELO DE INFECÇÃO

Os animais foram inoculados com formas promastigotas virulentas, obtidos na parte final da fase logarítmica de crescimento em meio de cultura, por via endovenosa ou intradérmica, ou com formas amastigotas isolados de baço ou fígado de hamsters previamente infectados, administrados por via endovenosa. Em todos os animais foi utilizado uma estirpe autóctone de L. infantum zimodemo MON-1, isolada a partir de casos humanos com leishmaniose visceral ou de cães naturalmente infectados. Na tabela encontram-se resumidas as características clínicas, parasitológicas e imunitárias apresentadas pela maioria dos cães experimentalmente infectados com promastigotas ou amastigotas de L. infantum. Inóculo de formas de promastigotas de cultura
Os cães inoculados com promastigotas de cultura quer por via intradérmica quer por via endovenosa, mantiveram-se assintomáticos, durante longos períodos de tempo (13-39 meses). Os animais não apresentaram alterações dos parâmetros hematológicos ou bioquímicos, no entanto, em alguns cães foi possível isolar o parasita em cultura, ou detectar a sua presença através da amplificação do DNA parasitário por PCR, em diferentes órgãos (gânglio linfático, baço e medula óssea). Estes animais ou produziram, transitoriamente, valores significativos de anticorpos ou não apresentaram resposta humoral específica [2,3]. Nenhum animal morreu durante o período de observação. Este tipo de inóculo, constituído por elevado número de parasitas virulentos de cultura na ausência de saliva do flebótomo, causa infecção do hospedeiro sem desenvolvimento de doença. Inóculo de formas amastigotas
Os animais infectados com amastigotas apresentaram um período de incubação relativamente alargado (4-11 meses) seguido pelo aparecimento de sinais clínicos externos (adenomegalia, descamação cutânea, lesões cutâneas, alopécia, onicogrifose e emagrecimento). A partir do 4º mês de infecção começaram a verificar-se alterações hematológicas (leucopenia, trombocitopenia e anemia) e bioquímicas (proteínas séricas totais elevadas e inversão da relação albumina/globulina). A existência de longos períodos assintomáticos na leishmaniose canina é perfeitamente conhecida, e em quase todos os inquéritos epidemiológicos efectuados estão descritas percentagens relativamente importantes de animais infectados com aparência saudável [4,5,6,7].Neste grupo de animais o parasita foi detectado, quer por isolamento em cultura quer por amplificação do seu DNA, no gânglio popliteo e na medula óssea entre o 3º e 6º mês após infecção. A partir do 6º mês de infecção o parasita foi detectado na pele aparentemente saudável. Posteriormente (a partir do 9º mês de infecção) o parasita foi encontrado no baço, no fígado, nas glândulas supra-renais e no rim. Estes animais desenvolveram marcada resposta humoral que se manteve até ao fim do período de observação. Um número limitado de cães tiveram de ser abatidos por se apresentarem gravemente doentes. Resposta imunitária humoral
Os animais inoculados com promastigotas mantiveram, de um modo geral, produção reduzida de anticorpos totais antileishmania, sendo os títulos de anticorpos inferiores ao título limite (diluição de 1:128) ou apresentaram resposta humoral transitória, com títulos de anticorpos totais (1:128 - 1:512) pouco elevados, detectados por imunofluorescência indirecta [2,3,8,9]. Os níveis de anticorpos antileishmania IgG1 e IgG2, quantificados através da técnica de ELISA, mantiveram-se bastante próximos dos valores observados nos animais saudáveis, embora ocorressem oscilações esporádicas mínimas [9]. Os animais inoculados com amastigotas desenvolveram títulos elevados de anticorpos totais antileishmania, a partir do 3º mês após a inoculação do parasita [2,3] com aumento de anticorpos IgG2. Em geral, os níveis de anticorpos IgG1 antileishmania mantém-se com valores muito semelhantes aos animais saudáveis, embora num número restrito de animais se tenha verificado aumento destes valores. Resposta imunitária celular
De um modo geral, e independentemente do inóculo escolhido ou da via de administração, as células mononucleares do sangue periférico não proliferaram quando estimuladas com antigénio total de L. infantum. No entanto, mantiveram resposta proliferativa positiva e geralmente elevada quando estimuladas não específicamente por um mitogénio (Concanavalina A). Porém, em alguns cães foi observada, ainda que de forma inconstante, proliferação significativa na presença do antigénio parasitário, no decurso da infecção. A ocorrência de resposta linfoproliferativa específica não parece estar relacionada com a resposta humoral, uma vez que é detectada em animais com ou sem valores significativos de anticorpos, nem com o estado clínico do animal, já que foi observada tanto em animais sintomáticos como em animais assintomáticos [9]. Em estudos imunitários transversais efectuados com cães experimentalmente infectados, foram observadas, em animais sintomáticos [2,3] e assintomáticos [10], respostas linfoproliferativas específicas para o antigénio parasitário. Em todos os cães saudáveis estudados foi detectado mRNA IFN-y, por RT-PCR, nas células mononucleares do sangue periférico inespecificamente estimuladas. Contudo, após a infecção esta citocina deixou de ser detectada na maioria dos animais durante um período relativamente curto (3 meses), ao fim do qual, os animais voltaram a expressar esta citocina, indicando assim que a introdução do parasita interfere com a capacidade dos linfócitos expressarem inespecificamente o IFN-. A expressão de IFN- e IL-10 em linfócitos estimulados com o antigénio parasitário e não estimulados só foi detectada em alguns dos animais infectados (7.7-16%), durante os primeiros nove meses após a administração do parasita, enquanto que a expressão de IL-2 nunca foi observada. Estes resultados sugerem que o contacto com o parasita ou não induz ou inibe a expressão destas citocinas pelo hospedeiro. Estudos prévios, efectuados com uma única observação, mostraram produção de IFN-, IL-2 e TNF pelas células mononucleares de sangue periférico de animais assintomáticos experimentalmente infectados com L. infantum [10]. INFECÇÃO NATURAL

A leishmaniose canina é caracterizada por apresentar um extenso período assintomático e uma acentuada resposta humoral [4]. Num estudo longitudinal (10-18 meses), por nós efectuado, em cães que permaneceram em área endémica durante a época de transmissão, tendo sido depois colocados no canil do IHMT com protecção para os flebótomos, verificou-se que estes animais tinham sido infectados e apresentavam um período pré-patente de duração variável ( 5 meses), seguido pelo aparecimento de sinais clínicos externos (dermatite exfoliativa, alopécia, queratite, adenomegalia do gânglio popliteo e caquexia). Os cães apresentaram alterações dos parâmetros hematológicos (trombocitopenia, anemia) e bioquímicos (aumento das proteínas sericas totais e hipergamaglobulinémia) e uma resposta humoral marcada com elevados níveis de anticorpos IgG2 antileishmania. Os anticorpos IgG1 específicos para o parasita mantiveram-se similares aos dos animais saudáveis. Foram detectados parasitas, no gânglio linfático e medula óssea, a partir do primeiro mês após o término da época de transmissão, e posteriormente na pele. As células mononucleares do sangue periférico mantiveram resposta proliferativa positiva quando estimuladas não específicamente por um mitogénio (Concanavalina A), independentemente do estado clínico do animal (fase pré-patente ou patente). Em alguns dos animais estudados foram observadas, no decurso da infecção, respostas linfoproliferativas positivas na presença de antigénio parasitário intercaladas por ausência de proliferação celular [9]. Num estudo efectuado por Cabral e colaboradores [11] em cães de uma área endémica de leishmaniose foram também detectados animais assintomáticos capazes de desenvolver resposta celular na presença de antigénio parasitário.CONCLUSÕES

Os inóculos utilizados nas infecções experimentais diferem dos inóculos da infecção natural por não conterem saliva do insecto vector, que parece ter um papel importante no sucesso da infecção [12,13], e por a quantidade de parasitas ser, muito provavelmente, bastante superior ao número de parasitas introduzidos na derme do hospedeiro durante a picada do vector. As infecções experimentais efectuadas em cães com as diferentes formas morfológicas de L. infantum permitiram verificar que os promastigotas de cultura são menos infecciosos que os amastigotas, pois estes induzem infecções que desenvolvem manifestações clínicas evidentes e apresentam marcada resposta humoral. Com base nestes resultados foram estabelecidos dois modelos de infecção experimental canina:

um modelo de infecção latente em que os animais apesar de se encontrarem comprovadamente infectados, embora com reduzida densidade parasitária, não desenvolvem doença, apresentam resposta humoral atenuada e podem desenvolver resposta linfoproliferativa específica; este modelo de infecção canino reproduz os cães naturalmente infectados assintomáticos (portadores sãos), e por isso aparentemente mais resistentes, que existem nas áreas endémicas de leishmaniose canina.
um modelo de infecção patente com várias semelhanças com a doença natural em que são evidentes as manifestações clínicas compatíveis com a leishmaniose. Tal como na infecção natural, os parasitas disseminam-se pelos diferentes órgãos internos durante o decurso da infecção e a pele saudável encontra-se parasitada, podendo eventualmente ocorrer transmissão do parasita ao insecto vector. A resposta humoral é marcada e a resposta celular apresenta-se de um modo geral atenuada, podendo existir animais com respostas linfoproliferativas significativas, específicas para o antigénio parasitário.

A imunologia da leishmaniose canina parece ser bastante diferente da leishmaniose verificada no modelo murino infectado com espécies dermotrópicas, onde existe uma clara associação entre a resposta Th1 e o controlo da infecção e a resposta Th2 e a progressão para a doença. Nos cães, a aparente inexistência de expressão de citocinas pelos linfócitos do sangue periférico durante o período pré-patente, sugere que este parasita é capaz de se instalar e invadir os diferentes órgãos do hospedeiro, evitando em simultâneo a activação da imunidade mediada por células. Adicionalmente, o desenvolvimento de respostas imunitárias celulares e as suas variações relativamente ao aparecimento de sintomatologia durante o decurso da infecção entre animais nas mesmas condições, apontam para a existência de flutuações da resposta imunitária de cada animal ao longo do tempo de infecção, que parecem reflectir a diversidade das manifestações clínicas e da resposta imunitária apresentada pela população canina infectada. Esta variações estão provavelmente relacionadas com as características genéticas de cada animal [9].O equilíbrio que se estabelece entre o parasita e o hospedeiro canino, traduzido por um período assintomático, habitualmente longo, em que parece não ocorrer reacções de imunidade celular adversas para o parasita:

permite a manutenção do ciclo de vida de L. infantum, uma vez que os animais assintomáticos são potencialmente infecciosos para os flebótomos [14] e;-
impede a morte prematura do hospedeiro, contribuindo para que os cães sejam bons reservatórios de L. infantum.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado por US-Israel AID-CDR com o projecto DPE-5544-G-SS-6020-00, Junta Nacional de Investigação Cientifica e Tecnológica através do projecto PBICT/BIA/2054/95, programa INCO-DC com o projecto IC18*CT950023 e SINDEPEDIP, Programa Projectos Mobilizadores para o Desenvolvimento Tecnológico na área da Saúde através do projecto IMUNOPOR.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Maurício, I .L., Howard, M. K., Stothand, J. R., Miles M. H. 1999. Genomic diversity in the Leishmania donovani complex. Parasitology, 119: 237-46
Abranches, P., Santos-Gomes, G., Rachamim, N., Campino, L., Schnur, L., Jaffe, C., 1991a. An experimental model for canine visceral leishmaniasis. Parasite Immunology 13, 537-550
Campino, L., Santos-Gomes, G., Riça-Capela, M. J., Cortes, S., Abranches, P. 2000. Infectivity of promastigotes and amastigotes of Leishmania infantum in a canine model for leishmaniosis. Veterinary Parasitology 92, 269-275
Abranches P., Silva Pereira M. C. D., Conceição-Silva F. M., Santos-Gomes, G. M., Janz J. G. 1991b. Canine leishmaniasis: pathological and ecological factors influencing transmission of infection. Journal of Parasitology 77, 557-561
Campino, L., Riça Capela, M., Maurício, I., Ozensoy, S., Abranches, P. 1995. O Kala-Azar em Portugal. IX. A região do Algarve: Inquérito epidemiológico sobre o reservatório canino no concelho de Loulé. Revista Portuguesa de Doenças Infecciosas 3-4, 189-194
Acedo-Sánchez, C., Morillas-Márquez, F., Sanchíz-Marín, M.C., Martin-Sánchez, J., 1998. Changes in antibody titres against Leishmania infantum in naturally infected dogs in southern Spain. Veterinary Parasitology 75, 1-8
Fisa, R., Gállego, M., Castillejo, S., Aisa, M.J., Serra, T., Riera, C., Carrió, J., Gállego, J., Portús, M., 1999. Epidemiology of canine leishmaniosis in Catalonia (Spain). The example of a Priorat focus. Veterinary Parasitology 83, 87-97
Santos-Gomes G. M., Campino, L., Abranches, P. 2000. Canine experimental infection: intradermal inoculation of Leishmania infantum promastigotes. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 95: 193198
Leandro, C., Santos-Gomes, G. M., Campino, L., Romão, P., Cortes, S., Rolão, N., Gomes-Pereira, S., Riça Capela, M. J., Abranches, P. 2001. Cell mediated immunity and specific IgG1 and IgG2 antibody response in natural and experimental canine leishmaniosis. Veterinary Immunology and Immunopathology 79, 273-284
Pinelli, E., Killick-Kendrick, R., Wagenaar, J., Bernadina, W., Real, G., Ruitenberg, J. 1994. Cellular and humoral immune responses in dogs experimentally and naturally infected with Leishmania infantum. Infection and Immunity 62, 229-235
Cabral, M., O’Grady, J., Alexander, J. 1992. Demonstration of Leishmania specific cell mediated and humoral immunity in asymptomatic dogs. Parasite Immunology 14, 531-539
Titus R. G., Ribeiro, J. M. C. 1990. The role of vector saliva in transmission of arthropod-borne disease. Parasitology Today, 6: 157-160
Morris, R. V., Shoemaker, C. B., David, J. R., Lanzaro, G. C., Titus R. G. 2001. Sandfly maxadilan exacerbates infection with Leishmania major and vaccinating against it protects against L. major infection. Journal of Immunology, 167: 5226-5230
Molina, R., Amela, C., Wieto, J., San-Andrés, M., González, F., Castillo, J., Lucientes, J., Alvar, J., 1994. Infectivity of dogs naturally infected with Leishmania infantum to colonized Phlebotomus perniciosus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 88, 491-493