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ResumenActualmente existen muchas evidencias sobre la participación del estrés oxidativo y las especies activas del oxígeno en la fisiopatología de diferentes enfermedades. La evaluación de los marcadores de estrés oxidativo mediante la utilización de técnicas de quimioluminiscencia sencillas, sensibles y rápidas sería de amplia utilidad para determinar la existencia de estrés oxidativo en el desarrollo de diversas patologías. La metodología propuesta permite evaluar y cuantificar, de manera no invasiva, las especies tóxicas del oxígeno y los sistemas antioxidantes presentes en una muestra de sangre del paciente. Asimismo, fue utilizada para estimar los marcadores periféricos de estrés oxidativo en la infección por HIV + (estadios tempranos), sida (estadios terminales), enfermedad de Parkinson (PK) y enfermedad de Alzheimer (ALZ). Las técnicas propuestas son quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de ter-butilo (CL) y capacidad antioxidante del plasma (TRAP). Los controles para el grupo de pacientes HIV + y sida incluyen individuos sanos con edades promedio entre 21 y 55 años y para los pacientes con PK y ALZ, entre 72 y 78 años de edad. Los resultados obtenidos confirman la existencia de estrés oxidativo asociado a la enfermedad expresado como un aumento de CL (33% en HIV, 82% en sida, 30% en PK y 78% en ALZ, p < 0.05). La TRAP mostró un incremento del 30% en HIV y del 57% en sida, respecto de los individuos tomados como control, mientras que se halla disminuida en un 42% y 24% en PK y ALZ, respectivamente (p <0.05). Estos datos podrían sugerir la asociación del estrés oxidativo en eritrocitos con el desarrollo progresivo de la enfermedad. Los parámetros evaluados indicadores de estrés oxidativo serían una herramienta interesante en el seguimiento de los pacientes durante la evolución y tratamiento de la enfermedad.IntroducciónEl estrés oxidativo es definido como el desbalance entre la generación de las especies reactivas del oxígeno y las distintas sustancias antioxidantes.1 Las células consumen oxígeno y generan varios intermediarios de reducción de oxígeno a través del sistema de oxidasas que producen tanto anión superóxido y peróxido de hidrógeno como radical hidroxilo. Esta condición está relacionada con la etiología o fisiopatología de diferentes enfermedades. Sin embargo, la determinación del grado de estrés oxidativo en humanos no se utiliza en el diagnóstico y seguimiento clínico de los pacientes debido, en parte, a que los métodos para determinar marcadores periféricos de estrés oxidativo aún no han sido ampliamente incorporados en las determinaciones de análisis clínicos.Los eritrocitos fueron utilizados como modelo para determinar el balance entre las especies prooxidantes y antioxidantes, situación que se define como estrés oxidativo.2 Además, están expuestos a altas tensiones relativas de oxígeno, contienen hemoglobina, hierro y una membrana plasmática rica en ácidos grasos poliinsaturados que los hace susceptibles a oxidaciones causadas por radicales y especies activas del oxígeno. Contienen, también, sistemas de defensa antioxidante que los protege del daño oxidativo causado por estas especies.El objetivo de este trabajo fue estudiar el nivel, en eritrocitos y plasma, de algunos de los marcadores periféricos de estrés oxidativo en pacientes infectados por el virus HIV en sus distintos estadios y en pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Materiales y métodosSelección de los pacientesA los pacientes seropositivos se les había realizado un ensayo de ELISA para HIV que fue confirmado por un análisis positivo de Western-blot. Los pacientes fueron clasificados de acuerdo al "Center for Disease Control and Prevention Criteria" (CDC).3El grado clínico de los pacientes con enfermedad de Parkinson, determinado según la escala "Hoehn y Yahr\'s", fue III-V.4 En la tabla 3 se resumen los datos clínicos de estos pacientes.El grado de severidad y nivel cognitivo de la enfermedad de Alzheimer fue establecido según el "Mini Mental State Examination and the Global Deterioration Scale Depression" y el "Hamilton Depression Scale".5Determinación de marcadores periféricosDeterminación de la quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de ter-butilo. La quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de ter-butilo (BOOH) es una técnica que permite evaluar el balance entre sustancias oxidantes y antioxidantes. Optimización de la técnica Elección de la solución de trabajo: se evaluaron las siguientes soluciones: (1) NaCl 0,9% P/V; (2) KCl 120 mM, glucosa 4 mM; (3) buffer fosfato 30 mM, KCl 120 mM; (4) buffer fosfato 30 mM, KCl 120 mM, glucosa 4 mM. Elección del pH óptimo: se trabajó en un rango de pH comprendido entre 5 y 9. A pH inferiores a 7 se observó una marcada disminución de la quimioluminiscencia y a pH mayores a 8 se produjo la lisis de los eritrocitos. Dependencia con la concentración de hidroperóxido de ter-butilo (BOOH): se trabajó en un rango de concentraciones entre 1 y 6 mM. Selección de la temperatura de trabajo: el rango de temperaturas evaluado estuvo entre 18-40 °C. Selección de la concentración óptima de glóbulos rojos: se trabajó con agregados de una solución 75/500 de glóbulos rojos. El rango de trabajo fue de 0 a 50 µl. Método de medidaLa quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de ter-butilo (BOOH) fue medida con un contador de centelleo líquido con el circuito de coincidencia desconectado. Se utilizó una suspensión de eritrocitos diluidos 75/500, colocados en buffer fosfato pH: 7.4. Los viales que contenían la mezcla fueron medidos para el registro de la emisión basal cuyo valor fue, generalmente, de 2500±600 cpm. Las medidas de quimioluminiscencia fueron iniciadas por el agregado de 30µl de BOOH 400 mM (concentración final en el medio de reacción 3 mM) y continuaron hasta alcanzar el máximo valor de emisión. Las determinaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Los resultados fueron expresados en cpm/mg de hemoglobina.6Determinación de la capacidad antioxidante del plasma La determinación de la capacidad antioxidante total del plasma permite evaluar en forma global los niveles de antioxidantes. Para ello se emplea una técnica de quimioluminiscencia en la que se utiliza como iniciador de la reacción al 2,2-azo-bis(2-amidinopropano) hidrocloruro (ABAP). Este compuesto genera radicales peroxilo por descomposición térmica espontánea y es muy soluble en agua. El ABAP formado actúa como sustractor de hidrógenos del luminol (LH2) que forma a su vez un radical. Las reacciones de los radicales peroxilo son seguidas por la quimioluminiscencia inducida por luminol (5-amino-2,3-dehidro-1-4-ftalazinediona).7 Cuando los antioxidantes presentes en la muestra reaccionan con los radicales del luminol provocan la desaparición de esta emisión hasta que todo el antioxidante haya sido consumido. Para evaluar la cantidad relativa de antioxidantes en la muestra se determinó el tiempo de inducción (ti) que se define como el tiempo que tardan en regenerarse los radicales del luminol responsables de la emisión de luz y que coincide con el momento en que toda la carga de antioxidantes presentes en la muestra fue consumida. Optimización de la técnica Elección de la concentración de luminol y ABAP: Se trabajó con concentraciones crecientes de luminol (20 y 40 µM) y concentración fija de ABAP (tabla 1), como también con concentraciones crecientes de ABAP (0.7, 2 y 20 mM) y concentración fija de luminol (tabla 1). Condiciones de trabajoLa determinación se llevó a cabo en un medio de reacción formado por ABAP (20 mM) en buffer fosfato 100 mM (pH: 7.4), 40 µM de luminol (en NaOH) en un contador de centelleo líquido con el circuito de coincidencia desconectado. Se realizó una medida basal y luego se agregaron partes alícuotas de plasma; al mismo tiempo se registró la emisión hasta recobrar los valores basales. El método se calibró utilizando un análogo hidrosoluble de la vitamina E, Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-ácido carboxílico que carece de la cadena isoprenoide lateral de la vitamina E), en concentraciones crecientes hasta 1 µM (figura 6).Los resultados se expresaron en µM de Trolox. Determinación de hemoglobinaLa conversión de hemoglobina en metacianohemoglobina por el reactivo de Drabkin fue comparada con una curva patrón.8 Los resultados se expresaron en g/dl de hemoglobina.ReactivosTodos los reactivos fueron adquiridos a Sigma, St. Louis, MO.Análisis estadísticoLas diferencias estadísticas fueron estimadas con el test de Student para muestras no apareadas. Las diferencias fueron consideradas significativas con un p < 0.05.ResultadosOptimización de la quimioluminiscencia de eritrocitosSe evaluaron cuatro soluciones tampones de las que se eligió la solución de KCl-fosfato como aquella que mostraba una mayor diferenciación de los resultados (figura 1). También se evaluó el efecto del cambio de pH en un rango comprendido entre 5.5 y 8; se eligió el pH 7.4 porque a esa actividad de protones se observa la máxima respuesta de la quimioluminiscencia (figura 2). Para determinar la concentracion óptima del iniciador de la reacción se trabajó con un rango de 1 a 6 mM de hidroperóxido orgánico. Como se observa en la figura 3, la linealidad se mantiene hasta la concentración de 3 mM, la cual fue elegida como la concentración óptima de trabajo.Dado que la temperatura de trabajo es un parámetro fundamental para esta técnica, se evaluó la emisión en un rango de temperaturas comprendido entre 18 y 40 °C y se decidió que 30 °C era la temperatura que mantenía pequeños cambios de emisión. Temperaturas superiores generaban cambios muy abruptos de la quimioluminiscencia (figura 4).La quimioluminiscencia muestra una relación lineal con el volumen de muestra agregado hasta un valor de 35 µl. Por encima de este valor se observó una pérdida de la linealidad; por lo tanto, se eligió trabajar con 30 µl de la dilución (figura 5).Pacientes de HIVEl incremento en la replicación viral se correlacionó con la depleción acelerada de linfocitos T CD4. Cuando el número de células CD4 disminuyó, el porcentaje de linfocitos infectados por el virus se incrementó en pacientes con sida. El porcentaje de CD4 disminuyó un 22% y 63% en pacientes HIV positivos (A1+B2) y en pacientes con sida (B3), respectivamente, en relación con el grupo control (tabla 2).Marcadores periféricos de daño oxidativoEn la tabla 3 se muestran las determinaciones de los marcadores periféricos de daño oxidativo para tres tipos de patologías relacionadas con el estrés oxidativo.Los pacientes con inmunodeficiencia adquirida mostraron un aumento de la emisión de los eritrocitos de un 33% en pacientes infectados con HIV (A1+B2) y de un 82% para el grupo con sida (B3) comparados con el grupo control. Cuando se analizó otro marcador periférico de estrés oxidativo como la capacidad antioxidante total del plasma (TRAP), se pudo observar un aumento de un 30% en infectados con HIV (A1+B2) y de un 57% para el grupo con sida (B3) comparados con el grupo control.Los pacientes con patologías neurodegenerativas como las enfermedades de Parkinson y de Alzheimer mostraron un aumento de la quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de ter-butilo de 30% y 78%, respectivamente. Del mismo modo, la evaluación del TRAP reflejó una disminución de sus antioxidantes endógenos totales para ambas patologías. Los pacientes con enfermedad de Parkinson mostraron una disminución del 42% mientras que aquellos que padecían la enfermedad de Alzehimer exhibieron un porcentaje del 24%.DiscusiónLas especies reactivas del oxígeno tales como anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y lipoperóxidos cumplen un importante papel en muchas patologías humanas. Durante el estallido respiratorio se produce peróxido de hidrógeno que reacciona con las membranas eritrocitarias generando lipoperoxidación9 y oxidación de los grupos sulfidrilos de las proteínas de membrana. Como consecuencia, la fluidez de la membrana y las propiedades mecánicas de las células cambia significativamente. El status de varias membranas ha sido evaluado utilizando la técnica de quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de ter-butilo.6 El ensayo es útil para estimar el balance entre los niveles de sustancias prooxidantes y el de las defensas antioxidantes no enzimáticas presentes en diferentes tejidos. En eritrocitos, la quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido orgánico aumentó significativamente en pacientes con sida, lo cual sugirió que los enfermos en este estado tendrían una excesiva producción de especies reactivas del oxígeno capaces de disminuir las defensas antioxidantes. Estos resultados son compatibles con los reportados por Favier y colaboradores10 quienes observaron, en pacientes infectados con HIV, un incremento en los niveles de peróxidos circulantes debido a la medida de hidroperóxidos y especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (MDA) en plasma. Los datos de la tabla 3 muestran que la emisión lumínica producida por la desexcitación de las especies excitadas en eritrocitos de pacientes infectados que aún no han desarrollado síntomas (estadio A1 y B2), es intermedia entre controles y pacientes con sida (estadio B3). Cuando se observan los resultados se advierte que no presentan diferencias significativas marcadas (p < 0.05, prueba no paramétrica de Kruskab-Wallis), pero asociados a la capacidad antioxidante total sugieren que los indicadores de estrés oxidativo están alterados aún en los estadios tempranos de la enfermedad. La luminiscencia aumentada en los eritrocitos de pacientes puede deberse a la desorganización de la membrana plasmática, la presencia de metales activos o a la disminución de las defensas antioxidantes. Existen varios informes sobre deficiencias de diferentes antioxidantes tanto en el estadio temprano como en pacientes con sida.11-12La capacidad antioxidante del plasma no mostró diferencias significativas entre el grupo control y los pacientes infectados, aunque se observó un pequeño incremento en el grupo de pacientes con sida, probablemente, como consecuencia del tratamiento con la droga DDI que podría tener propiedades antioxidantes.11 En los pacientes con Parkinson se han observado algunos hechos bioquímicos -como el incremento de la concentración de óxido nítrico y peróxido de hidrógeno en los neutrófilos y la baja actividad de catalasa eritrocitaria- que sugieren la participación de las especies activas del oxígeno en la fisiopatología de esta enfermedad. Los resultados del presente estudio presumen un desbalance entre las concentraciones de especies oxidantes y sustancias antioxidantes determinados por el aumento en la fotoemisión de los eritrocitos.13 Asimismo, se puede encontrar una disminución en la capacidad antioxidante total del plasma que está claramente relacionada con una situación de estrés oxidativo. Los estudios sobre la enfermedad de Alzheimer están focalizados, en su mayoría, en la caracterización de los cambios observados en las distintas áreas del cerebro, realizándose el diagnóstico final en muestras cadavéricas. La evaluación de marcadores periféricos es sumamente importante debido a que podría ayudar a un diagnóstico precoz de esta patología.14 Se han evaluado los cambios oxidativos en el cerebro de los pacientes y se hallaron aumentados los niveles de malondialdehído catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. Existen resultados contradictorios, ya que distintas áreas presentan respuestas heterogéneas en la protección antioxidante.15En conclusión, los datos obtenidos en este trabajo permiten afirmar que las técnicas de quimioluminiscencia de alta sensibilidad permiten evaluar situaciones de estrés oxidativo en distintas patologías y podrían constituir una herramienta útil para el médico en el seguimiento de estos pacientes a lo largo de su evolución clínica.(COLOCAR LA FIGURA 1)Figura 1. Cinética de emisión de los eritrocitos utilizando 4 soluciones buffer diferentes como medio de reacción.(COLOCAR LA FIGURA 2)Figura 2. Fotoemisión de los eritrocitos iniciada por hidroperóxido de ter-butilo en función del pH.(COLOCAR LA FIGURA 3)Figura 3. Quimioluminiscencia iniciada de eritrocitos en función de la concentración de hidroperóxido de ter-butilo (BOOH).(COLOCAR LA FIGURA 4)Figura 4. Emisión máxima de los eritrocitos en función de la temperatura de trabajo.(COLOCAR LA FIGURA 5)Figura 5. Quimioluminiscencia iniciada por BOOH en función del volumen de muestra(COLOCAR LA FIGURA 6)Figura 6. Variación de la luminiscencia del luminol inducida por ABAP por el agregado de diferentes concentraciones de Trolox. Recuadro superior: relación lineal entre el tiempo de inducción (ti) y la concentración de Trolox.Bibliografía1. Halliwell B, Cross CE. «Reactive oxygen species, antioxidants and acquired immunodeficiency syndrome. Sense or speculation», Arch Intern Med 151:29-31, 1991.2. Cross C, Halliwell B. «Oxygen radicals in human disease», Ann Intern Med 107:526-545, 1987.3. Council of state and territorial epidemiologists. AIDS Program center for Infections diseases, Centers for disease control. «Revision of the CDC suveillance case definition for acquired immunodeficiency syndrome», MMWR 36:35-155, 1987.4. Gibb W, Lees A. «The relevance of the Lewy body to the pathogenesis of idiopathic Parkinson\'s disease», J Neurol. Nerurosurg. Psychiatry. 51: 745-752, 1988.5. 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Conclusión breve
Principal: Diagnóstico por Laboratorio, 