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El procedimiento no es realizable en células con diferenciación completa ya que éstas no pueden dividirse. También es muy dificultoso en células tumorales con bajo índice mitótico. El desarrollo de sondas moleculares y su utilización mediante la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) ha ayudado a expandir y complementar la información obtenida por los estudios citogenéticos tradicionales. Sin embargo, el aspecto más importante para el patólogo es la posibilidad de aplicar esta metodología para obtener información citogenética en células fuera del período de mitosis, es decir, en interfase, y en células que hayan completado su diferenciación. Esta técnica es conocida como citogenética del núcleo en interfase (CNI). Así es posible obtener información genética en núcleos de células en extendidos celulares convencionales de citogenética, citología, improntas de tejidos frescos, suspensiones celulares, disgregados de tejidos y cortes de material incluido en parafina.En los últimos años se han sintetizado sondas de ADN específicas. Cada sonda es una secuencia de ADN complementaria del ADN en cuestión y su tamaño varía entre algunos cientos a millones de pares de bases. En la actualidad existen sondas disponibles para diferentes dominios estructurales de los cromosomas (centrómeros, telómeros), así como también para cromosomas enteros («cromosomas pintados») y secuencias únicas de genes. Estas sondas pueden ser detectadas con la técnica de FISH (fluorescent in situ hybridization) mediante fluorescencia, o NISH (non-fluorescent in situ hybridization) mediante detección enzimática (peroxidasa o fosfatasa alcalina). Las sondas pueden estar marcadas con fluorocromos, biotina o digoxigenina. En estos últimos la detección se realiza en forma indirecta con avidina-fluoresceína o antidigoxigenina-fluoresceína respectivamente. Las señales pueden ser amplificadas a través de sucesivas incubaciones. El procedimiento puede completarse en el término de 24 horas. Debido a que algunas secuencias de ADN son compartidas por los distintos cromosomas, es necesario trabajar bajo condiciones sumamente rigurosas para evitar hibridación cruzada y verificar la especificidad mediante extendidos de metafases corridos en forma simultánea.Es muy importante tener en cuenta que la sonda a utilizar debe ser seleccionada y dirigida en base a los hallazgos clínicos, citogenéticos y/o anatomopatológicos. Los resultados deben ser interpretados de acuerdo con un análisis cuantitativo de valores significativos y teniendo en cuenta las dificultades propias de la situación, tales como, por ejemplo, que un corte histológico no siempre permite visualizar el lugar donde está el centrómero del cromosoma en estudio. También la superposición de núcleos puede dificultar la interpretación. Las señales fluorescentes deben tener más o menos la misma intensidad y se considera como cifra óptima la presencia de menos del 15% de núcleos «negativos».En un extendido de un cultivo celular la sonda genera una señal que aparece en la región específica correspondiente en cada copia del cromosoma diana. En un núcleo en interfase aparece una señal asociada a la región específica del cromosoma diana marcado. La presencia de 2 señales indica la presencia de 2 copias del ADN marcado. De esta manera es posible la detección de anomalías numéricas de los cromosomas contando el número de dominios de hibridación por núcleo. El uso combinado de 2 sondas, detectadas mediante diferentes fluorocromos, permite además la detección de anomalías estructurales tales como translocaciones en núcleos en interfase.La técnica de FISH ha demostrado ser de utilidad en citogenética convencional para la identificación y detección de cromosomas, aneuploidías, cromosomas marcadores, mosaicismos, microdeleciones, translocaciones y amplificación de genes.Las aplicaciones de procedimiento de la CNI incluyen:1) Examen complementario de los productos de la concepción: detección de anomalías cromosómicas numéricas (triploidías, tetraploidías, trisomías, monosomías) y mosaicismos. Este procedimiento es extremadamente útil en aquellos casos de antecedente de aborto previo o feto muerto, feto malformado, retardo del crecimiento intrauterino o antecedente de translocación balanceada en uno de los padres, en los que no fue posible el cultivo in vitro, ya sea porque no fue satisfactorio o no se contó con material para estudio citogenético convencional. La selección de las sondas de ADN específicas para cada uno de los cromosomas a utilizar depende de la integración de los datos clínicos (antecedentes de diagnóstico de aberración cromosómica en aborto[s] anterior[es]) y de los hallazgos del examen anatomopatológico del producto de la gestación que sugieran un patrón de lesiones compatibles con un síndrome en particular. La capacidad del procedimiento de poder correlacionar la morfología celular con el cariotipo permite, además, individualizar alteraciones cromosómicas del trofoblasto y estroma vellositario, y así la detección de mosaicismos confinados a la placenta. En el caso particular de placentas con degeneración hidrópica, el FISH permite discriminar entre cambios secundarios a retención, mola y triploidía.2) Diagnóstico prenatal: el análisis de células amnióticas no cultivadas permite adelantar el diagnóstico prenatal de las aneuploidías más frecuentes (13,18,21,X).3) Detección de cromosomas sexuales como marcadores de enfermedad: detección del cromosoma Y en biopsia de vellosidad corial para el diagnóstico de enfermedades ligadas al X; detección de cromosomas X e Y en casos de genitales ambiguos; detección de cromosomas X e Y para la identificación de enfermedad residual en pacientes que recibieron trasplante de médula ósea de un dador de sexo opuesto.4) Detección de mosaicismos: detección de isocromosoma 12 en extendidos celulares de mucosa yugal para el diagnóstico del Síndrome de Pallister-Killian.5) Investigación del cariotipo tumoral: los estudios citogenéticos convencionales han demostrado la presencia de alteraciones cromosómicas constantes en gran número de tumores. Sin embargo, sus resultados dependen del análisis selectivo de aquellas células con mayor índice mitótico. Mediante la CNI es posible el estudio de todas las células y no sólo de aquellas detenidas en metafase. De este modo es posible estudiar un mayor número de células e identificar pequeñas poblaciones. Además permite la discriminación entre células normales y anormales, y posibilita una correlación entre la morfología y la ploidía celular y la identificación de cromosomas marcadores. Entre las aberraciones cromosómicas específicas de utilidad diagnóstica en patología se encuentran la detección de: del(11p) en el rabdomiosarcoma embrionario; i(12p) en tumores de células germinales; del (13)(q14) en el retinoblastoma; +2, +20 en el hepatoblastoma; +8, +11, +17, +20 en el fibrosarcoma congénito; t(11;22) en el tumor neuroectodérmico primitivo, entre otros. Son indicadores de mal pronóstico el hallazgo de del(1p) y amplificación del oncogen N-myc en el neuroblastoma.6) Aplicaciones en hematopatología: gran número de enfermedades hematológicas se correlacionan con patrones clínicos, morfológicos e inmunofenotípicos. El reconocimiento además de alteraciones cromosómicas de los mismos tiene, en algunos casos, un significado diagnóstico o pronóstico de importancia para el tratamiento y seguimiento de los pacientes. Son ejemplos de utilidad diagnóstica la detección de: +8 en el síndrome mielodisplásico y policitemia vera, la t(15;17) en la leucemia prolmielocítica aguda, la t(9;22) en la leucemia mieloide crónica. La detección de t(4;11) es de pronóstico desfavorable en la leucemia de células pequeñas de la infancia en tanto que la observación de inv(16) es de pronóstico favorable en la leucemia mielocítica aguda.La incorporación de la biología molecular a la citogenética convencional ha redundado notablemente en beneficio de la citogenética clínica. Hoy, la capacidad de la CNI permite además la correlación de los hallazgos citogenéticos con los detalles morfológicos así como el análisis retrospectivo del material de archivo como fuente de información para la epidemiología molecular.Si bien el método está limitado al marcador utilizado, el procedimiento está dirigido a detectar aquellas alteraciones sospechadas de acuerdo a los hallazgos morfológicos.En la actualidad, los patólogos tienen la posibilidad no sólo de detectar fenotipos celulares a través de marcadores de superficie y citoplasmáticos sino también ahondar dentro del núcleo en busca de aberraciones cromosómicas. El desarrollo de nuevas sondas y la aplicación progresiva de esta metodología permiten el reconocimiento de nuevos patrones cromosómicos. La integración de estos datos con la clínica redundará sin duda en la obtención de valiosa información diagnóstica y pronóstica para el paciente y una mejor comprensión de la patogenia y epidemiología de las enfermedades.
Conclusión breve
Principal: Anatomía Patológica, 