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VALOR DE LAS TIRAS DE ETEST DE PENICILINA V Y PENICILINA G PARA LA REALIZACION DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD DE NEISSERIA MENINGITIDIS
(especial para SIIC © Derechos reservados)
Autor:
Omar Daher,
Columnista Experto de SIIC

Artículos publicados por Omar Daher, 
Coautores Horacio A. Lopardo*  Etelvina A. Rubeglio** 
Doctor en Ciencias Bioquímicas, Jefe del Servicio de Microbiología del Hospital de Pediatría "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos Aires, y Prof. Titular de Microbiología Clínica de la Facultad de Cien*
Doctora en Medicina, ex Jefa del Servicio de Microbiología del Hospital de Pediatría "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos Aires, Argentina (E.A.R.)**


Recepción del artículo: 27 de febrero, 2004
Aprobación: 22 de marzo, 2004
Conclusión breve
Etest sólo con tiras de penicilina G, es un método alternativo conveniente y confiable para determinar la CIM de penicilina en aislamientos de N. meningitidis

Resumen

Los métodos de Etest y de dilución en medio sólido han sido aceptados por el NCCLS para efectuar pruebas de sensibilidad a penicilina en Neisseria meningitidis. En el presente trabajo se determinó la CIM de penicilina V y de penicilina G, tanto por Etest como por el método de dilución en agar, utilizando 43 aislamientos de N. meningitidis. Aunque los resultados obtenidos para las cepas de referencia con ambas drogas estuvieron dentro del rango aceptable según las pautas de control de calidad, se observaron diferencias de dos o tres diluciones entre los dos antibióticos con ambos métodos. Las pruebas realizadas con penicilina V utilizando los puntos de corte correspondientes a penicilina G no pueden predecir correctamente la sensibilidad a penicilina G para N. meningitidis. Sin embargo, al ajustar los puntos de corte de penicilina V dos diluciones por encima de los de penicilina G (p.ej. S ≤ 0.25 y R ≥ 8 μ g/ml), podrían alcanzarse valores acordes con los obtenidos utilizando esta última. Se logró una concordancia del 98% (dentro del rango de ± 1 dilución) entre Etest y el método de referencia cuando se utilizaron tiras de penicilina G. Resultados similares se observaron con penicilina V. Podemos concluir que Etest, sólo con tiras de penicilina G, es un método alternativo conveniente y confiable para determinar la CIM de penicilina en aislamientos de N. meningitidis.

Palabras clave
Neisseria meningitidis, meningococo, penicilina V, penicilina G, sensibilidad

Clasificación en siicsalud
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Especialidades
Principal: BioquímicaFarmacología
Relacionadas: Diagnóstico por LaboratorioEpidemiologíaInfectologíaPediatría

Enviar correspondencia a:
Prof. Dr. Horacio A. Lopardo, Servicio de Microbiología, Hospital de Pediatría "Prof. Dr. Juan P. Garrahan". Combate de los Pozos 1881 (1245) Buenos Aires, Argentina. Lopardo, Horacio


Patrocinio y reconocimiento
AgradecimientosLos autores agradecen a las doctoras A. Procopio (Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez", Buenos Aires), M. C. Ceinos (Hospital de Pediatría "Prof. Dr. J. P. Garrahan", Buenos Aires) y M. Regueira (INEI-ANLIS Instituto de Microbiología "Dr. Carlos G. Malbrán", Buenos Aires) por la provisión de las cepas de N. meningitidis. También se agradece la excelente asistencia técnica de Alejandra Mastroianni. Los autores agradecen muy especialmente a la Dra. Anne Bolmström por la revisión crítica del manuscrito inicial.

VALOR DE LAS TIRAS DE ETEST DE PENICILINA V Y PENICILINA G PARA LA REALIZACION DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD DE NEISSERIA MENINGITIDIS

(especial para SIIC © Derechos reservados)
Artículo completo
Introducción
Históricamente, Neisseria meningitidis fue considerado sensible a la penicilina, en consecuencia, ésta fue seleccionada como el antibiótico de elección para el tratamiento de las infecciones meningocócicas. Sobre la base de la extensa experiencia clínica, la penicilina continúa siendo el antibiótico más frecuentemente utilizado para tratar infecciones debidas a N. meningitidis.1 Sin embargo, durante la década del '90, se comenzaron a describir aislamientos de N. meningitidis con sensibilidad disminuida a penicilina en varios países,2-4 incluida la Argentina.5 Las CIM siempre estuvieron por debajo de 2 μ g/ml y el mecanismo de resistencia fue reconocido como debido a la disminución de la afinidad de las PBP a los betalactámicos.2,3 El significado clínico de esta resistencia es incierto puesto que no se registaron fallas terapéuticas en pacientes con meningitis causadas por N. meningitidis con sensibilidad disminuida a penicilina tratados con altas dosis de dicho antibiótico.1 Sin embargo, creemos que es necesario realizar una vigilancia epidemiológica para poder reconocer algún impacto futuro. Por otra parte, se describieron pocas cepas de meningococos productores de betalactamasas4 y en algunos de esos casos sí se observaron fallas terapéuticas con penicilina.4
Para la realización de pruebas de sensibilidad con N. meningitidis no resulta apropiado el método de difusión con discos6 sino el de dilución en medio sólido.7 El método de Etest también es frecuentemente usado y ha demostrado buena correlación con el método de referencia.8-10 Como la administración intravenosa de penicilina G es la forma recomendada para el tratamiento de las infecciones graves por meningococos, ésta es la droga utilizada para la realización de las pruebas de sensibilidad in vitro. No obstante, también están disponibles en el mercado las tiras de penicilina V para realizar las pruebas de Etest y algunos laboratorios podrían llegar a utilizarlas por error como alternativa frente a cepas de N. meningitidis.
El objetivo de este estudio fue comparar los métodos de Etest y de dilución en medio sólido para realizar pruebas de sensibilidad a penicilina con aislamientos de N. meningitidis utilizando alternativamente penicilina V y penicilina G.
Materiales y métodos
Bacterias
Se utilizaron 43 aislamientos clínicamente significativos de N. meningitidis obtenidos en tres diferentes centros de Buenos Aires, Argentina. Estos aislamientos fueron identificados y serotipificados por métodos convencionales (21 eran del serogrupo B; 15, del serogrupo C; 4, del serogrupo W-135, y 3, del Y).
Como cepas de referencia para efectuar el control de calidad de las pruebas se utilizaron Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 y Staphylococcus aureus 29213.
Medios de cultivo
Las placas de agar sangre al 5% (AS) fueron preparadas con base de agar Mueller Hinton sin suplementar con cationes (Difco Laboratories, Detroit, EE.UU.) y con el agregado de 5% (v/v) de sangre ovina desfibrinada (A. Gutiérrez, Buenos Aires, Argentina). Este medio fue utilizado para la realización de ambos métodos.
Pruebas de sensibilidad
Se utilizaron penicilina G (INEI-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán", División Antimicrobianos, Argentina) y penicilina V (Aventis Pharma, Argentina) como drogas puras de potencia valorada para el método de dilución en medio sólido. Para efectuar las pruebas de Etest se emplearon las tiras comerciales de penicilina G (rango 0.002 – 32 μg/ml) y de penicilina V ( rango 0.016 – 256 μg/ml) (AB Biodisk, Solna, Suecia).
Método de dilución en medio sólido: Se prepararon las placas de AS usando el procedimiento recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS),7 incluyendo un espectro de concentraciones de 0.002-4 μg/ml tanto para penicilina V como para penicilina G. Los inóculos fueron preparados ajustando su turbiedad con la de un patrón de sulfato de bario corerespondiente al tubo N° 0.5 de la escala de Mc Farland. Las placas fueron inoculadas con una suspensión no diluida de cada uno de los microorganismos empleados utilizando un replicador de Steers. De este modo, en cada gota se depositaron aproximadamente 105 unidades formadoras de colonias. Estas placas fueron incubadas a 35°C durante 24 horas en una atmósfera con 5% de CO2.
Etest: Las CIM de penicilina G y penicilina V se determinaron por Etest utilizando las tiras comerciales respectivas. La turbiedad del inóculo también en este caso fue ajustada según el tubo N° 0.5 de la escala de McFarland y se empleó un hisopo de algodón para efectuar las estrías en tres direcciones en las placas de AS. Después de una incubación de 24 horas a 35°C en una atmósfera con 5% de CO2 se leyó el valor de CIM de la escala impresa en la tira en el punto de intersección entre ésta y el halo elíptico de inhibición. Los aislamientos fueron categorizados como sensibles a penicilina (CIM ≤ 0.06 μg/ml), con sensibilidad intermedia (CIM entre 0.125 y 1 μg/ml) y resistentes (CIM ≥ 2 μg/ml).1 Para comparar los métodos de Etest y dilución en medio sólido, los valores intermedios de Etest fueron cambiados por los de la dilución inmediata superior.
Análisis estadístico
a) Errores
Los resultados obtenidos por Etest cuyas interpretaciones difirieron levemente con las del método de referencia [sensible (S) - intermedio (I), resistente (R ) - I, I - R o I - S] fueron considerados errores menores. Los resultados que fueron sensibles por Etest y resistentes por dilución fueron interpretados como errores mayores, y los resistentes por Etest pero sensibles por dilución, como errores medios.11
b) Curvas de distribución
Estas se realizaron mediante diagramas de dispersión de acuerdo con lo clásicamente recomendado en la literatura para este tipo de estudios.12
Resultados
Se observó que los resultados de CIM obtenidos con penicilina V eran superiores a los obtenidos con penicilina G por el método de dilución en agar. La mayoría de las cepas (93%) mostraron diferencias de dos a tres diluciones (figura 1a). Casi los mismos resultados se obtuvieron con Etest (figura 1b) . Sin embargo, los valores de CIM obtenidos tanto con penicilina V como con penicilina G con las cepas de referencia (Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 y Staphylococcus aureus 29213), cayeron dentro de los rangos aceptados de control de calidad para penicilina G según el NCCLS (datos no mostrados).






Cuando se efectuó la interpretación de los datos, se observaron diferencias sustanciales entre los correspondientes a penicilina G y penicilina V tanto por dilución en agar (74% de errores menores) como por Etest (84% de errores menores). Sin embargo, si se ajustaran los puntos de corte para penicilina V en dos diluciones (p.ej. S ≤ 0.25 y R ≥ 8 μg/ml) los errores menores descenderían al 2.3%.
Se observó una buena correlación y un elevado porcentaje de coincidencia entre Etest y dilución en medio sólido, tanto para penicilina V como para penicilina G (figura 2, tabla 1). No se registraron cepas resistentes a ninguna de las dos drogas por lo que sólo se observaron errores menores. Se detectaron sólo dos errores menores con Etest para penicilina G respecto de los resultados obtenidos por dilución y sólo en un caso se observó una diferencia mayor a una dilución entre los dos métodos empleados.






Discusión
La penicilina V (fenoximetilpenicilina) se absorbe mejor que la penicilina G en el tracto gastrointestinal humano además de ser más resistente a la acidez gástrica. Por estos motivos es que la penicilina V se utiliza para el tratamiento oral de ciertas infecciones. Su actividad frente a cocos grampositivos es casi equivalente a la de penicilina G, pero se describió menor actividad frente a gramnegativos como Neisseria spp. y Haemophilus spp.13 Aunque la penicilina G es el antibiótico representativo del grupo de las penicilinas para realizar pruebas de sensibilidad con N. meningitidis (NCCLS) no existen recomendaciones especiales que desalienten el uso de penicilina V. Además, los resultados de las CIM de penicilina V fueron similares a los obtenidos con penicilina G en los ensayos de control de calidad con S. pneumoniae ATCC 49619 y con S. aureus ATCC 29213. Estos valores cayeron dentro de los rangos establecidos para penicilina G por el NCCLS.7 Algunos laboratorios podrían de manera inadvertida utilizar alternativamente penicilina G o V para las pruebas de sensibilidad con N. meningitidis, más aun si se tiene en cuenta que existen tiras de Etest disponibles para ambas drogas.
Este estudio mostró entre 74% y 84% de errores menores, con diferencias de dos a tres diluciones entre las CIM de penicilina V y penicilina G con ambos métodos de ensayo. Por otra parte, pudo observarse que las pruebas de Etest constituyen una opción conveniente y confiable para la determinación de CIM de penicilina G en N. meningitidis . No se recomienda el uso de penicilina V como alternativa equivalente para el ensayo de penicilina G en N. meningitidis, a menos que se definan puntos de corte especiales para esta droga.
Los autores no manifiestan conflictos.
Bibliografía del artículo
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