<B><I> </B></I>INVESTIGACION ADICIONAL EN LA TECNICA DIG-ELISA: UN NUEVO PUNTO FINAL EN ELISA

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IntroducciónLa técnica DIG-ELISA (diffusion-in-gel enzyme-linked immunosorbent assay),¹ llamada también inmunodifusión radial revelada enzimáticamente,² es un método sencillo, barato y sensible para medir la concentración de anticuerpos en una muestra. La técnica original¹ fue modificada por el autor de este artículo a fin de incrementar su sensibilidad y su fiabilidad.²A pesar de las mejoras introducidas, la técnica presenta un inconveniente: el tiempo de ejecución es excesivamente largo (24 horas para medir la concentración de anticuerpos de clase IgG y 48 horas para medir la concentración de anticuerpos de clase IgM). Estos tiempos tan largos se deben a la difusión lenta de los anticuerpos IgG, y especialmente IgM, en un gel de agar o de agarosa.Algunos investigadores han aprovechado el fenómeno de la electroendósmosis para mover anticuerpos en una membrana de nitrocelulosa^3,4 (al aplicar un campo eléctrico a una membrana, o a un gel, con cargas negativas fijas, sólo los iones de carga positiva se desplazan hacia el polo negativo, con lo que arrastran su capa de hidratación y se produce un flujo de líquido hacia el polo negativo; este flujo arrastra los compuestos no cargados presentes en el gel). Por consiguiente, el autor de este artículo aplicó el mismo principio para desplazar más rápidamente los anticuerpos en una membrana de nitrocelulosa o en un gel (gellan gum); la nitrocelulosa tenía el antígeno adsorbido y el gel cubría una superficie de poliestireno con el antígeno adsorbido a ella. Los resultados no fueron satisfactorios por dos motivos: en primer lugar, era necesario mucho tiempo para alcanzar un desplazamiento aceptable (por ejemplo, 3 a 4 horas para un desplazamiento de 3 a 5 cm), y por otra parte, las áreas que contenían el anticuerpo, visualizadas mediante el mismo procedimiento que en la inmunodifusión radial revelada enzimáticamente,² tenían los bordes difusos, lo que no permitía una medida exacta de su área.La técnica ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) resuelve el problema de la movilidad de los anticuerpos al hacer una dilución seriada de éstos y revelar enzimáticamente las zonas que tienen anticuerpo; un espectrofotómetro mide la absorbancia de las zonas coloreadas y un gráfico de la absorbancia frente a la concentración de la muestra patrón da una curva que permite leer la concentración de las muestras problema.^5,6Si no se dispone de un espectrofotómetro, se debe encontrar una forma alternativa de determinar la concentración de anticuerpos. En principio, se pensó que en una fotografía digital de una placa de ELISA revelada enzimáticamente, la intensidad de color de cada pocillo se podría expresar por un número que representa el componente rojo, verde y azul del color: un gráfico del color frente a la concentración de anticuerpos de la muestra patrón daría una curva que permitiría leer la concentración de la muestra problema. Se comprobó esta idea mediante la enzima peroxidasa y una mezcla de 3,3'-diaminobencidina y cloruro de níquel como sustrato; además, se intensificó el color resultante por deposición de plata.^7,8 Entonces ocurrió un hecho inesperado: a medida que disminuía la concentración de anticuerpos, disminuía la intensidad del color (como era de esperar) hasta que, a una cierta concentración, el color se volvía más intenso y luego se desvanecía a concentraciones mínimas. Por consiguiente, el incremento de la intensidad del color podría utilizarse como punto final para la titulación de la muestra.Este artículo muestra que el procedimiento del punto final da una estimación aproximada de la concentración de anticuerpos, y que el procedimiento es relativamente preciso.Materiales y métodosReactivosLa 3,3'-diaminobencidina tetraclorhidrato dihidrato (DAB) se compró a Fluka (Alcobendas, Madrid, España), y los reactivos siguientes se compraron a Sigma (Alcobendas, Madrid, España): glutaraldehído (disolución al 25%), tampón fosfatos pH 7.4 (PBS), poli (lisina, fenilalanina) bromhidrato (lisina:fenilalanina = 1:1, peso molecular 20 000-50 000), etanolamina clorhidrato, IgG humana, IgM humana, anticuerpos puros de cabra anti-IgG humana, anticuerpos puros de cabra anti-IgM humana, anticuerpos de cabra puros anti-cadenas κ humanas conjugados a peroxidasa, anticuerpos de cabra puros anti-cadenas λ humanas conjugados a peroxidasa, anticuerpos de cabra puros anti-IgG de ratón conjugados a peroxidasa, y anticuerpos de cabra puros anti-IgM de ratón conjugados a peroxidasa.Animales e inmunizaciónSe utilizaron 10 ratones hembras de la cepa RjOrl:Swiss, de 3 meses de edad (comprados a Janvier España, Madrid, España). Los ratones se alojaron en grupos de 4 por jaula, a 21 1^oC, y recibieron abundante comida y agua. Se inyectaron los ratones intraperitonealmente con diferentes dosis de eritrocitos de rata (de la cepa Long Evans): dos ratones recibieron 1x10⁷ eritrocitos, dos ratones 5x10⁷ eritrocitos, tres ratones 1x10⁸ eritrocitos, y tres ratones 1.5x10⁸ eritrocitos; los glóbulos rojos se suspendieron en PBS y cada ratón fue inyectado con 0.1 ml de la suspensión. A los 16 días, cada ratón recibió una inyección de recuerdo con la misma dosis inicial y fue sangrado 5 días más tarde.Inmunodifusión radial revelada enzimáticamente (DIG-ELISA)Esta técnica es la misma que mejoró el autor de este artículo,² con dos modificaciones: los estromas de eritrocitos se unieron a poli (lisina, fenilalanina) mediante glutaraldehído, en vez de mediante ácido subérico bis (N-hidroxisuccinimida éster), y la concentración del reactivo de plata utilizado fue la mitad de la concentración utilizada anteriormente.Técnica ELISA modificadaPara medir la concentración de inmunoglobulinas humanas se adsorbieron anticuerpos anti-IgG humana o anti-IgM humana, a placas de 96 pocillos para ELISA (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.), según el procedimiento de Hobbs (1989):⁹ se incubaron las placas durante toda la noche con poli (lisina, fenilalanina), 40 μg/ml en PBS, 50 μl/pocillo, se lavaron 3 veces con agua, y se incubaron con glutaraldehído al 0.5% en PBS (50 μl/pocillo) durante 30 min, se lavaron 2 veces con agua y una con salino, se incubaron con IgM humana (15 μg/ml en PBS) o con IgG humana (15 μg/ml en PBS), durante 60 min, se lavaron con salino y se incubaron con etanolamina clorhidrato (1 mg/ml en PBS, 50 μl/pocillo) durante 30 min, se lavaron 2 veces con salino y una vez con PBS-Tween.Para medir la concentración de anticuerpos antieritrocitos de rata se unieron los estromas de los eritrocitos a los pocillos de una placa de ELISA de la forma siguiente: se adsorbió la poli (lisina, fenilalanina) como se describió antes, se añadió una suspensión de eritrocitos al 1% en salino, 50 μl/pocillo; después de que los glóbulos sedimentaran durante 30-40 min, se eliminaron los glóbulos no adheridos por lavado con salino y los glóbulos adheridos se lisaron con PBS:agua (1:10, v/v); después de varios lavados con PBS:agua (1:10) para eliminar la hemoglobina se fijaron los estromas con glutaraldehído al 0.1% en PBS, 50 μl/pocillo, durante 30 min; se neutralizó la actividad peroxidásica por incubación con peróxido de hidrógeno al 0.3% en PBS, 50 μl/pocillo, durante 15 min; los pocillos se lavaron 3 veces con salino, se incubaron durante 30 min con etanolamina, 1 mg/ml en PBS, 50 μl/pocillo; los pocillos se lavaron 2 veces con salino y una vez con PBS-Tween.Se hizo una dilución seriada de las muestras que contenían anticuerpos (IgM humana, IgG humana o anticuerpos antieritrocitos) en una placa de ELISA; el factor de dilución fue 2 y el vehículo PBS-Tween con gelatina (1 mg/ml); cada pocillo recibió 50 μl de líquido. Al cabo de 90 min, se lavaron los pocillos 3 veces con PBS-Tween, se añadió el conjugado de peroxidasa correspondiente (anticuerpos anticadenas κ y λ humanas o anticuerpos anti-IgM o IgG, de ratón) en PBS-Tween-gelatina, 50 μl/pocillo, y se mantuvo la incubación durante 90 min; al cabo de este tiempo, se reveló la placa con diaminobencidina-níquel, durante 20 a 30 min, y con un revelador de plata⁸ durante 10 a 15 min.Se incluyó una muestra patrón (una disolución de inmunoglobulinas humanas de concentración conocida o un suero de ratón rico en anticuerpos antieritrocitos de rata) en cada placa de ELISA. Los resultados se expresan mediante el cociente: concentración de anticuerpos en la muestra problema / concentración de anticuerpos en la muestra patrón.Antes efectuar la técnica ELISA se debe encontrar la dilución apropiada de cada conjugado de peroxidasa, ya que la dilución para ELISA sugerida por el fabricante suele ser mayor que la dilución apropiada para la técnica descrita en este artículo.ResultadosEl fenómeno básicoUna muestra de IgG humana (a 10 mg/ml), y otra de IgM humana (a 1 mg/ml), se valoraron según el método ELISA descrito en el apartado anterior; las diluciones de IgG iban de 1:10 000 a 1:20 480 000 (pocillos B1 a B12 en la Figura 1), y las diluciones de IgM iban de 1:100 a 1:204 800 (pocillos E1 a E12). Una vez revelada la placa (Figura 1), se observa una intensificación de color en la dilución 1:80 000 de IgG (pocillo B4) y en la dilución 1:1 600 de IgM (pocillo E5).

Figura 1. El fenómeno básico.Fila B: dilución seriada (factor de dilución 2) de una disolución de IgG humana (de concentración 10 mg/ml), de 1:10 000 (pocillo B1) a 1:20 480 000 (pocillo B12); los pocillos tenían anticuerpos anti-IgG unidos a la superficie. Fila C: dilución seriada de la disolución de IgG como en la fila B, pero había albúmina de cabra unida a los pocillos. Pocillos D1-D3: pocillos con anticuerpos anti-IgG unidos pero no se incubaron con IgG. Fila E: dilución seriada (factor de dilución 2) de una disolución de IgM humana (de concentración 1 mg/ml), de 1:100 (pocillo E1) a 1:204 800 (pocillo E12); los pocillos tenían anticuerpos anti-IgM unidos a la superficie. Fila F: dilución seriada de la muestra de IgM como en la fila E, pero había albúmina de cabra unida a los pocillos. Pocillos G1-G3: pocillos con anticuerpos anti-IgM unidos pero no se incubaron con IgM. Se reveló la placa con peroxidasa y diaminobencidina-níquel, con intensificación del color resultante con plata. Se observa cambio de color a la dilución 1:80 000 para la IgG (pocillo B4) y a la dilución 1:1 600 para la IgM (pocillo E5).

Las filas C y F corresponden a la ELISA ejecutada en pocillos recubiertos con albúmina de cabra (en lugar de con anticuerpos): la ausencia de color en esas filas demuestra que no hay adsorción inespecífica de la IgG, de la IgM o del conjugado de peroxidasa. Los pocillos D1, D2, y D3, que se recubrieron con anticuerpos anti-IgG humana y no se incubaron con IgG no dieron color. De igual manera, los pocillos G1, G2, G3, que se recubrieron con anticuerpos anti-IgM pero no se incubaron con IgM, tampoco dieron color. Los pocillos D4, D5, D6 (recubiertos con IgG) y los pocillos G4, G5, G6 (recubiertos con IgM) no recibieron el conjugado de peroxidasa y, por tanto, tampoco dieron color.Validez del nuevo procedimientoLa intensificación abrupta de color que ocurre a medida que se diluye la muestra se puede utilizar para estimar el punto final de la titulación. Esta idea se comprobó de la forma siguiente: se prepararon varias muestras de IgM humana por dilución de una disolución de la misma (1 mg/ml) y se determinó la concentración de IgM de cada muestra por el procedimiento descrito en este artículo (se utilizó la disolución sin diluir como muestra patrón). Una gráfica de la concentración estimada frente a la real da una distribución lineal: la ecuación de la recta es [concentración estimada de IgM = -0.81 + 0.92* (concentración real de IgM)]; el error estándar del intercepto y de la pendiente es 13.1 y 0.11, respectivamente, el coeficiente de correlación es 0.94, y el número de puntos es 12. La diferencia entre el intercepto (-0.81) y 0 no alcanza significación estadística [t (10) = 0.062; p = 0.95], así como tampoco la alcanza la diferencia entre la pendiente (0.92) y 1 [t (10) = 0.76; p = 0.46].Se llevó a cabo la misma prueba de validez para la medida de la IgG humana. Una gráfica de la concentración estimada frente a la real da una distribución lineal: la ecuación de la recta es [concentración estimada de IgG = 110.67 + 0.78* (concentración real de IgM)]; el error estándar del intercepto y de la pendiente es 127.0 y 0.12 respectivamente, el coeficiente de correlación es 0.89 y el número de puntos es 13. La diferencia entre el intercepto (110.67) y 0 no alcanza significación estadística [t (11) = -0,87; p = 0.40], así como tampoco la alcanza la diferencia entre la pendiente (0.78) y 1 [t (11) = 1.83; p = 0.089]. Cuando se representa gráficamente el logaritmo decimal de la concentración de IgG estimada frente al logaritmo decimal de la concentración real de IgG se obtiene una recta cuya ecuación es: [log₁₀ IgG estimada = 0.07 + 0.97 * log₁₀IgG real]; el error estándar del intercepto es 0.12 y el de la pendiente es 0.051; el intercepto no difiere de 0 [t (11) = 0.58; p = 0.57] y la pendiente no difiere de 1 [t (11) = 0.59; p = 0.56]; el coeficiente de correlación es 0.98.Los resultados anteriores muestran una buena correlación lineal entre la concentración real de inmunoglobulinas y la concentración medida por la técnica descrita en este artículo. Ahora bien, todas las muestras tenían anticuerpos de la misma afinidad, porque todas las muestras provenían de la misma disolución original. Por consiguiente, era necesario comprobar si la relación lineal se mantenía con los anticuerpos presentes en el suero sanguíneo de diferentes sujetos. Para comprobar esto, se inmunizaron 10 ratones con eritrocitos de rata y se midió la concentración de anticuerpos antieritrocitos por dos métodos: DIG-ELISA, un método establecido,² y el método descrito en este artículo. Para los anticuerpos IgM, la relación entre la concentración de anticuerpos por ambos métodos viene dada por una recta, cuya ecuación es [IgM por el nuevo método = 0.27 + 0.53 * IgM por DIG-ELISA]; el coeficiente de correlación fue 0.72; el error estándar del intercepto y de la pendiente fue 0.32 y 0.18 respectivamente; el intercepto no difería de 0 [t (8) = 0.85; p = 0.42] pero la pendiente era menor que 1 [t (8) = 2.61; p = 0.031]. Para los anticuerpos IgG, la ecuación de la recta fue [IgG por el nuevo método = 0.04 + 1.04 * IgG por DIG-ELISA]; el coeficiente de correlación fue 0.79; el error estándar del intercepto y de la pendiente fue 0.12 y 0.28 respectivamente; el intercepto no difería de 0 [t (8) = 0.32; p = 0.76] y la pendiente no difería de 1 [t (8) = 0.14; p = 0.89].Reproducibilidad del nuevo métodoPara calcular la reproducibilidad intraensayos, se midieron, en la misma placa, las concentraciones de IgM, o de IgG, de 4 réplicas del mismo suero humano y se repitió la medida en 2 placas más. El coeficiente de variación medio ponderado¹⁰ era de 11.1% para la IgM y de < 1% para la IgG.Para calcular la reproducibilidad entre ensayos, se midió, en 4 placas diferentes, la concentración de IgM, o de IgG, en un suero humano. El coeficiente de variación fue de 31.8% para la IgM y 12.4% para la IgG.La sensibilidad del procedimiento (la concentración de anticuerpo en la que ocurre el cambio de color) se calculó a partir de la muestra de suero humano utilizada para la estimación de la reproducibilidad. Para la IgM, la media ( el error estándar) de 4 determinaciones fue 1.9 0.6 μg/ml; para la IgG, la media ( el error estándar) de 4 determinaciones fue 0.09 0.02 μg/ml.DiscusiónEn este artículo se presenta un nuevo método para determinar el punto final de una dilución seriada de anticuerpos en ELISA. En este método, el punto final viene dado por la intensificación de color que ocurre, a cierta concentración de anticuerpos, en placas de ELISA reveladas con diaminobencidina-níquel-plata. Para que el nuevo método tenga aplicación tiene que ser preciso (es decir, que la concentración medida sea igual a la real) y reproducible (que el coeficiente de variación no sea demasiado alto). Se comprueban ambos supuestos en este artículo.Se comprobó la precisión creando varias muestras de IgM o de IgG humanas a partir de una disolución de concentración conocida, midiendo la concentración por el método descrito aquí, y representando gráficamente la concentración medida frente a la real. En condiciones ideales, el intercepto de la recta resultante tendría que ser 0, y la pendiente 1. Para la IgM, la diferencia del intercepto (-0.81) con 0 no era estadísticamente significativa, y tampoco era significativa la diferencia de la pendiente (0.92) con 1 (Resultados). Para la IgG, la diferencia del intercepto (110.67) con 0 no era estadísticamente significativa, así como tampoco lo era la diferencia de la pendiente (0.78) con 1 (Resultados). Aunque estos resultados están de acuerdo con lo esperado (intercepto = 0, pendiente = 1), se observa una gran dispersión en el intercepto (error estándar = 127) lo que podría deberse al efecto desigual sobre la regresión que ejercen las concentraciones mayores (el intervalo de concentraciones iba de 10 μg/ml a 2 500 μg/ml). Una forma de solucionar el problema es expresar las concentraciones (real y medida) como logaritmos decimales y representar gráficamente las variables en forma logarítmica; entonces, el intercepto (0.07 0.12) es prácticamente 0 y la pendiente (0.97 0.051) es prácticamente 1.La prueba anterior se hizo en condiciones óptimas, ya que los anticuerpos de todas las muestras eran iguales. Una prueba más realista es encontrar la relación entre la concentración de anticuerpos, en distintos sujetos, medida con la técnica descrita en este artículo y la concentración medida con una técnica establecida, ya que la afinidad de los anticuerpos producidos por cada sujeto es amplia. Esta prueba se llevó a cabo con el suero sanguíneo de 10 ratones inmunizados con eritrocitos de rata; los anticuerpos antieritrocitos se midieron con la técnica descrita aquí y con la DIG-ELISA mejorada,² que también utiliza el sistema peroxidasa / diaminobencidina-níquel-plata. Para la IgG se obtiene una recta aceptable (intercepto = 0.04; pendiente = 1.04), mientras que para la IgM se obtiene una recta subóptima (intercepto = 0.27, cuya diferencia con 0 no es significativa, p = 0.42; y pendiente = 0.53, que es menor que 1, p = 0.031). No obstante, estas relaciones son comparables a otras descritas entre diferentes métodos para medir anticuerpos en las mismas muestras; por ejemplo, 4 métodos diferentes de medir anticuerpos anti-ADN (ensayo de Farr, ensayo del polietilenglicol, inmunofluorescencia en Crithidia luciliae y ELISA) dieron coeficientes de correlación en el intervalo 0.53-0.85,¹¹ que son similares a los obtenidos con la nueva técnica y DIG-ELISA (0.72 para los anticuerpos IgM antieritrocitos y 0.79 para los anticuerpos IgG).¿Cuál es la ventaja de la versión de ELISA descrita aquí sobre otras versiones usadas actualmente Básicamente, la mayor sencillez y el menor costo, ya que la técnica ELISA convencional utiliza un espectrofotómetro multicanal para medir la absorbancia del color en los pocillos y la técnica "dot-blot" utiliza un densitómetro para medir la intensidad del color de las manchas (spots);^12,13 como la nueva técnica utiliza el ojo para evaluar el punto final, resulta más barata y sencilla. Por consiguiente, esta nueva versión de ELISA es recomendable para los laboratorios que tienen un bajo presupuesto y que no necesitan una medida muy precisa de la concentración de anticuerpos.AgradecimientoEste trabajo se financió con una beca (Número BSO 2000-0661) del Ministerio de Educación de España.