EXPRESION DEL GEN DE LA RENINA COMO MARCADOR DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL EN LEUCEMIAS AGUDAS

Conclusión breve
Consideramos que la determinación del gen de la renina por PCR es un indicador útil de enfermedad mínima residual en pacientes que no tengan otro marcador para dicha determinación.

Resumen

Determinadas leucemias se caracterizan por una alteración molecular por PCR en el diagnóstico, lo que constituye un marcador de enfermedad mínima residual (EMR). Puesto que experimentos previos han demostrado expresión del gen de la renina fundamentalmente en pacientes afectados por leucemia mieloblástica aguda (LMA), el objetivo de este trabajo es estudiar la incidencia y el valor de la expresión de dicho gen como marcador molecular de EMR en aquellos pacientes afectados por LMA que carezcan de otros marcadores. Analizamos 78 muestras de pacientes afectados por LMA y los seguimientos de los pacientes positivos, utilizando como metodología de trabajo RT-PC y PCR en tiempo real. Se encontró positividad en 31 de los 78 pacientes (39.74%). En todos los casos positivos en el diagnóstico se observó la negativización con la remisión completa, la reaparición en la recaída y la persistencia en caso de enfermedad refractaria al tratamiento. En los pacientes que presentaban otro marcador citogenético o molecular se observó un comportamiento similar en ambos durante el curso clínico de la enfermedad. Consideramos que la determinación del gen de la renina por PCR es un indicador útil de EMR en pacientes que no tengan otro marcador para dicha determinación. La técnica de PCR en tiempo real que se describe presenta ventajas sobre la PCR, ya que demostró mayor sensibilidad que esta última.

Palabras clave
Renina, leucemia, enfermedad mínima residual, marcador molecular, PCR en tiempo real

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Especialidades

Principal: Diagnóstico por Laboratorio, Hematología,

Relacionadas: Bioquímica, Genética Humana, Oncología,

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Dra. Silvia de la Iglesia Iñigo. Hospital de Gran Canaria Doctor Negrín. C/ Barranco de la Ballena S/N. 35020 Las Palmas de Gran Canaria. España. de la Iglesia Iñigo, Silvia

RENIN EXPRESSION AS MINIMAL RESIDUAL DISEASE MARKER IN ACUTE LEUKEMIAS

Abstract
Some leukemias have at diagnosis a molecular change useful as minimal residual disease (MRD) marker. The aim of this paper is to study the incidence and value of renin gen expression as MRD molecular marker in acute mieloid leukemia (AML) patients without other molecular marker. We analized 78 samples of AML and the follow-up of positive patients, using PCR and real time-PCR. 31 of 78 patients were positive (39.74%). We observed negativization in all positive cases with the complete remission, recurrence in the relapse and persistence if the disease is refractive to the treatment. In patients with other cytogenetic or molecular marker we observed a similar behaviour in both of them along with the disease evolution. We think that renin gene analysis by PCR is a useful marker of MRD in patients that lack others. The real time-PCR methodology that we describe has more sensitivity than PCR.

Key words
Renin, leukemia, minimal residual disease, molecular marker, real time-PCR

EXPRESION DEL GEN DE LA RENINA COMO MARCADOR DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL EN LEUCEMIAS AGUDAS

(especial para SIIC © Derechos reservados)

Artículo completo
Introducción
El uso de métodos diagnósticos con mayor sensibilidad que la morfología nos permite la detección de enfermedad mínima residual (EMR) y el tratamiento precoz de las recaídas.^1-5 Determinadas neoplasias hematológicas se caracterizan por una alteración molecular que constituye un marcador para el diagnóstico y monitorización de la EMR por PCR.^8-12 En aquellos casos de leucemia aguda sin un marcador genético específico debe considerarse la búsqueda de otros marcadores¹³ como la expresión del gen del tumor de Wilms (WT1),^14-16 del gen del retinoblastoma^17,18 o la sobreexpresión del FLT3.¹⁹
Las evidencias de la existencia de los componentes del sistema renina angiotensina en la médula ósea,^20-22 con efectos sobre la hematopoyesis,^23-30 junto con la demostración de la existencia de renina y expresión de dicho gen en blastos de determinadas leucemias^31,32 nos llevó a analizar la expresión del gen de la renina en médulas óseas procedentes de nuestros pacientes afectados por leucemia mieloblástica aguda (LMA) con el objetivo de analizar la incidencia y estudiar el valor de dicha expresión como marcador molecular de EMR en aquellos pacientes positivos al diagnóstico que carezcan de otros marcadores moleculares. En este artículo se amplía la serie de pacientes publicada previamente por nuestro grupo³³y se introduce como metodología de trabajo la PCR en tiempo real.^34,35
Pacientes y método
Se determinó la incidencia de la expresión del gen de la renina en 9 muestras de sujetos sanos y en 78 pacientes afectados por LMA no promielocítica (tabla 1). El análisis se realizó en muestras pertenecientes a diagnóstico, remisión completa y recaída, pudo realizarse el seguimiento de 19 pacientes positivos para renina. Las muestras no valorables, por mala calidad del ARN existente, no fueron incluidas en el estudio.

Los pacientes fueron clasificados inicialmente según la clasificación de la FAB³⁶ y posteriormente se utilizó únicamente la propuesta por la WHO³⁷ o se combinaron ambas, tal y como se recomienda. Asimismo, se utilizó la clasificación inmunológica en los casos dificilmente asignables con la clasificación morfológica o a los que no se les practicó aspirado medular.³⁸
Las células mononucleadas fueron obtenidas de las muestras de medula ósea o de sangre periférica anticoaguladas con EDTA y se aislaron mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque. El ARN total fue extraído mediante el método del tiocianato de guanidino-fenol ácido.³⁹ Se aseguró la integridad del ARN mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. La concentración del ARN se determinó mediante espectrofotometría y los ARN se almacenaron en un congelador a –80ºC.
El ADNc de las secuencias de ARN fue obtenido a partir de 1 μg de ARN usando la transcriptasa inversa AMV (Boehringer Manheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La desnaturalización y la síntesis de ADNc se realizó en un termociclador a 95º C durante 10 minutos seguidos de 42º C durante 60 minutos, respectivamente. La determinación del gen de la renina se realizó inicialmente por RT-PCR⁴⁰ y electroforesis en gel de agarosa y, posteriormente, por PCR en tiempo real con SYBR Green I.
Para la amplifcación del gen de la renina por PCR en tiempo real se utilizó el Light Cycler Instrument. Se usaron dos cebadores específicos (REN F y REN R) a una concentración 0.5 μM y el colorante fluorescente SYBRGreen I (Fast Start DNA Master SYBR Green I). Para la determinación del gen control β-glucuronidasa (GUS) se utilizó el cebador directo ENF y el inverso ENF 1102 (tabla 2). Las condiciones para la amplificación de las muestras se definen en la tabla 2, mientras que las de análisis de la curva de fusión se establecieron según las indicaciones del instrumento. La fluorescencia fue medida en el canal F1 (530 nm).

Resultados
Se encontró positividad en 31 de los 78 pacientes analizados (39.74%) (tabla 1). Las características de los pacientes positivos para renina se resumen en la tabla 3.

En todos los pacientes renina positivos al diagnóstico se observó la negativización de dicha expresión con la remisión completa. Asimimo, se observó la reaparición de dicha positividad en la recaída y la persistencia de dicha expresión cuando existía enfermedad refractaria al tratamiento, siempre y cuando la celularidad medular fuera adecuada (tabla 4 y figura 1). La PCR en tiempo real presentó mayor sensibilidad que la RT-PCR, mostrando positividad en algunos casos negativos por RT-PCR. En los pacientes que presentaban otro marcador citogenético o molecular se observó un comportamiento similar en ambos durante el curso clínico de la enfermedad.
Tabla 4

Figura 1. Imagen de la determinación (curva de fusión) de la expresión del gen de la renina por PCR en tiempo real del seguimiento de un paciente positivo al diagnóstico. Al diagnóstico (en verde) se observa un pico con la misma temperatura de fusión que el control positivo (en azul). Las muestras pertenecientes a la remisión completa (rojo y negro) son negativas. En la recaída (en rosa) reaparece la positividad.

Discusión
Estos datos corraboran la prevalencia de la expresión de este gen en LMA.^32,33 En contra de lo publicado por Wulf y col.,³² no encontramos una mayor prevalencia de la positividad del gen de la renina en los pacientes afectados por LMA con componente monocitoide (LMA-M4 y LMA-M5).
Según nuestros resultados, la expresión del gen de la renina se relaciona con el número de blastos, se negativiza con la desaparición de éstos y reaparece en la recaída, lo cual sugiere que la determinación del gen de la renina mediante PCR en tiempo real es de utilidad por su sensibilidad para el seguimiento de la EMR. La técnica que se describe, de PCR en tiempo real, presenta ventajas sobre la PCR convencional al realizar los seguimientos, ya que demostró mayor sensibilidad que esta última.
Esta técnica permite la cuantificación de la expresión del gen, lo cual se ha demostrado de utilidad en el seguimiento de otros marcadores de EMR,^15,34,35 por lo que creemos de interés estandarizar dicha técnica para realizar la cuantificación de los seguimientos de nuestros pacientes positivos.
De todos estos datos se concluye que la determinación del gen de la renina por PCR es un indicador útil de EMR en los pacientes que no presenten otro marcador para dicha determinación.
Los autores no manifiestan conflictos

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