IMPACTO DEL ESTRES OXIDATIVO SOBRE LA CAPACIDAD FECUNDANTE DEL GAMETO MASCULINO Y SU ASOCIACION CON ANTICUERPOS ANTIESPERMATOZOIDES

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Estrés oxidativo
Mecanismos de origen en el espermatozoide
La importancia del estrés oxidativo en la etiología de la infertilidad masculina se conoce desde 1943, cuando John Mac Leod demostró que la catalasa agregada a espermatozoides humanos en condiciones aeróbicas podía mantener la movilidad de éstos.¹
Desde hace algunos años ha crecido el interés de los investigadores por la producción de las denominadas especies reactivas de oxígeno (ERO) en el tracto reproductor masculino debido a los efectos tóxicos que generan sobre la calidad y la función espermáticas.² El conocimiento de que el espermatozoide es vulnerable al estrés oxidativo (EO) inducido por las ERO fue confirmado por numerosos estudios. Estas sustancias reactivas han sido detectadas en elevadas concentraciones en muestras seminales de hombres infértiles.^3,4
No obstante lo expuesto, hay también evidencias que sugieren que pequeñas cantidades de ERO son necesarias para que el espermatozoide adquiera capacidad fertilizante.⁵ Un nivel fisiológico de ERO podría inducir la capacitación espermática y los eventos relacionados con ella como la reacción acrosómica y la hiperactivación.⁶
Aunque el mecanismo de acción de las ERO en estos fenómenos fisiológicos no se conoce con claridad, podrían estar involucradas en la regulación de la fosforilación de proteínas en tirosina.⁷
Luego se estableció que el EO en el espermatozoide se produce como resultado de un desequilibrio entre la generación de ERO y la cantidad de antioxidantes específicos que posee la célula.⁸ La razón de la particular susceptibilidad al daño producido por el EO, es que los espermatozoides contienen en su membrana grandes cantidades de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA).⁹ Además, la cantidad de enzimas antioxidantes que poseen los espermatozoides no puede proteger en su totalidad la membrana plasmática que cubre la cabeza y la cola. De esta manera, ellos dependerán para defenderse de la protección ejercida por el propio plasma seminal.¹⁰
Es necesario agregar además, que el EO no sólo ataca la fluidez de la membrana plasmática sino también la integridad del ADN nuclear.⁵ En realidad, el EO es considerado por algunos autores como el factor más importante en la patología del factor masculino. Sin embargo, no existe acuerdo total para utilizar su valoración como práctica clínica.¹¹ Posiblemente, un argumento para que esto ocurra sea la falta de protocolos estandarizados.
Hay claras evidencias de que un factor significativo en la etiología de la infertilidad masculina es la pérdida de la capacidad fecundante como consecuencia del EO. Este mecanismo se genera por una producción incontrolada de ERO. Estas sustancias atacan los ácidos grasos no saturados del plasmalema y, como consecuencia, producen inmovilidad, envejecimiento y muerte celular.
El mecanismo por el cual los espermatozoides producen ERO no está aún totalmente aclarado. Se ha propuesto la participación de una NADPH oxidasa, generadora de anión superoxido O₂-, similar a la encontrada en los leucocitos.
La peroxidación lipídica (LPO) es una autooxidación y se inicia cuando se forma un radical hidroperoxilo, que no es otra cosa que el ácido conjugado del anión superóxido. Esto se produce por captura de un hidrógeno del grupo metileno bis alílico de la molécula de los ácidos grasos. Los radicales libres en presencia de oxígeno producen a su vez radicales peroxilos (ROO), que se estabilizan por conversión al correspondiente hidroperóxido (ROOH) o bien por autooxidación o por la obtención de un átomo de hidrógeno de un lípido adyacente.
Estos hidroperóxidos en presencia de metales de transición se descomponen en productos sumamente tóxicos como los aldehídos, en especial el malondialdehído (MDA) (figura 1). Esta sustancia ha sido la base para la reacción con el ácido tiobarbitúrico, usada como ensayo de LPO en espermatozoides humanos.¹²

Figura 1. Esquema de la peroxidación lipídica.

Uno de los mayores problemas que se producen al determinar ERO en diferentes poblaciones de espermatozoides humanos es su invariable contaminación con leucocitos.¹³ En respuesta a esta problemática se introdujeron técnicas bioquímicas sensibles, como el uso de un péptido quimiotáctico (N-formil metionil leucil fenilalanina) para determinar leucocitos en diferentes poblaciones de espermatozoides.¹⁴ Al respecto se ha estudiado ampliamente la relación existente entre los defectos de la función y los elevados niveles de quimioluminiscencia generados por el luminol o la lucigenina sobre los gametos masculinos,^15,16 dado que la quimioluminiscencia no discrimina entre ERO provenientes de leucocitos activados de los producidos por los espermatozoides.
La orientación de los ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática permite la fluidez óptima para que el espermatozoide cumpla con sus funciones específicas.¹⁷ La peroxidación lipídica puede comprometer la fluidez de la membrana y, como consecuencia de esto, la función de numerosas bombas y canales que regulan el intercambio iónico y la concentración de nutrientes. Como ejemplo podemos mencionar las ATPasa.
En general se acepta que el efecto más significativo de la LPO sobre la membrana es la perturbación de su estructura y de su función. Es así que los niveles bajos de NADPH y glutatión y el aumento de la actividad de la glutatión peroxidasa afectarán la homeostasis de Ca⁺⁺ celular.¹⁸
Recientemente se demostró que las subpoblaciones de espermatozoides separados por gradientes de Percoll generan altos niveles de quimioluminiscencia en las capas de baja densidad.¹⁵ Estos espermatozoides presentan exceso de citoplasma residual y, como consecuencia de ello, un aumento en la generación de ERO a través del incremento de NADPH.¹⁶
El daño peroxidativo iniciado por las ERO, además de producir la pérdida de la funcionalidad de membrana, se asocia también con daño del ADN de la cabeza espermática.¹⁹ Tanto los factores ambientales como el consumo de tabaco inducen EO sistémico, produciendo una disminución de vitaminas antioxidantes en el plasma seminal, además del daño del ADN espermático.²⁰
En circunstancias normales, los espermatozoides con daño del ADN no pueden participar en los procesos de fertilización por el daño peroxidativo colateral que se produjo en la membrana plasmática.²¹
Dos factores protegen el ADN espermático del ataque oxidativo: el característico empaquetamiento del ADN nuclear y la presencia de antioxidantes del plasma seminal.
Se realizaron estudios en los cuales los espermatozoides fueron expuestos a una producción artificial de ERO. Como consecuencia de esto se observó un aumento significativo del daño al ADN en forma de modificaciones de las bases, deleciones y reordenamiento cromosómico, entre otros.²² El EO se correlaciona también con la ruptura simple o doble de las hélices del ADN.²³ A pesar de la clara existencia de un impacto deletéreo del EO y la LPO sobre la capacidad fecundante del espermatozoide humano, la falta de estandarización de ensayos para medir dichos procesos ha incidido en el rendimiento de su relevancia clínica.
Es importante para la clínica andrológica conocer la producción de ERO de una muestra determinada y saber si ésta es genuinamente espermática o involucra el infiltrado leucocitario. En estos casos los valores que se obtienen son muy diferentes de los observados cuando la única fuente son los espermatozoides.²⁴
Pruebas diagnósticas
Es de aceptación corriente que una sola prueba no puede establecer la capacidad fertilizante del varón.²⁵ Además, toda valoración debe tener un umbral que provea capacidad predictiva para discriminar entre un hombre fértil de uno infértil. Este es un punto importante por su aplicabilidad en andrología clínica. La validez de la evaluación de la infertilidad masculina es dificultosa por un buen número de razones que escapan al propósito de esta revisión.
Mucho se ha trabajado en el desarrollo de pruebas adecuadas para estudiar las ERO y el EO que puedan ayudar en el conocimiento de la infertilidad masculina.^26,27
Dado que el EO expresa un desequilibrio entre los niveles de producción de ERO y la protección antioxidante del semen²⁸ es pues concebible que el estudio del EO pueda realmente conocerse a través de la valoración de las ERO y de la capacidad antioxidante total de la muestra de semen (TAC).
En una suspensión de espermatozoides, los diferentes niveles de ERO pueden medirse utilizando quimioluminiscencia.²⁹ A su vez, la TAC en el plasma seminal puede también medirse a través de un ensayo quimioluminiscente.³⁰ Es por ello que se propuso un índice ERO-TAC para poder diagnosticar el estrés que afecta a los gametos masculinos.²⁶
El nitroblue tetrazolium (NBT) es un colorante muy soluble en agua que es reducido por los radicales libres de oxígeno al aceptar electrones. El resultado de esta reducción es un cambio de color que vira al azul oscuro por la formación de formazán.³¹ En esta reacción el NADPH citoplasmático que se produce por oxidación de la glucosa sirve como donante de electrones. El sistema oxidasa disponible en el citoplasma ayuda a transferir electrones desde el NADPH al NBT y lo reduce a formazán. Luego el NBT refleja indirectamente la actividad generadora de ERO en el citoplasma celular y puede ayudar a determinar el origen de dichas sustancias en una suspensión variada de células, como las que presenta el semen.
Se ha mencionado que tanto la movilidad progresiva rápida de los espermatozoides así como la morfología normal evaluada por criterios estrictos son los mejores predictores de fertilización in vitro.³² No obstante, las pruebas funcionales en uso no pueden evaluar los cambios que los espermatozoides deben soportar como consecuencia de una incubación prolongada antes de que se produzca la fertilización del ovocito.
Para la cuantificación de LPO, se utiliza el método del ácido tiobarbitúrico que emplea cantidades catalíticas de Fe⁺⁺ y ascorbato, con la formación de malondialdehído (MDA).³³
Sobre la base del conocimiento que se tiene de los mecanismos de producción del EO, recientemente se desarrolló el Estrés Test Modificado (MOST), con el objeto de predecir la fertilización de ovocitos in vitro en el contexto de técnicas de reproducción asistida.³⁴
Valores bajos de MOST indican un aumento de la peroxidación lipídica que puede interferir con la capacidad fértil del espermatozoide. El valor de corte de la prueba fue de 0.39, ya que esa cifra corresponde a la más alta sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo y valor predictivo positivo de la prueba.³⁴ Valores bajos de MOST también sugieren que la inseminación de ovocitos con más del 61% de espermatozoides que pierden la movilidad después de una incubación de 4 horas a 40°C es incompatible con la tasa de fertilización normal, probablemente debido a un potencial alto de LPO en dichas muestras. En este trabajo se utilizó Ham's F10 como medio de cultivo ya que posee metales de transición que promueven una peroxidación lipídica forzada.³⁴
Relevancia clínica
Se han llevado a cabo numerosos estudios de infertilidad, en los que la atención se centró especialmente en los mecanismos de EO para conocer el daño que esto provoca en los gametos masculinos.³⁵
Como ya se dijo, el espermatozoide humano es capaz de generar cantidades bajas y controladas de ERO endógenas que juegan un importante papel en la inducción de la capacitación y de la reacción acrosómica y en la adquisición de la capacidad fertilizante.³⁶
Elevados niveles de anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y óxido nítrico ponen en peligro la movilidad espermática, la viabilidad y la función de los gametos al interactuar con los lípidos de membrana, las proteínas y el ADN nuclear y mitocondrial.³⁷
No obstante, para entender los mecanismos biológicos del EO y su relación con la fertilidad es necesario tener en cuenta el daño que se produce sobre las células germinales in vivo, las consecuencias de dicho daño sobre los componentes celulares y los mecanismos que regulan la defensa de la membrana plasmática.
La causa fundamental de la disfunción y de la fisiopatología de la infertilidad es muchas veces difícil de diagnosticar por parte del andrólogo. En general, la mayor parte de los pacientes infértiles tienen una muestra seminal anormal, de variada gravedad y de etiología escasamente conocida.
Hasta que no conozcamos mejor las causas de la infertilidad es poco probable que alguna prueba en particular determine la calidad espermática o su funcionalidad o pueda predecir con certeza absoluta si un hombre es fértil o infértil en un determinado período de su vida.³⁸
Otra de las razones que dificultan el estudio es la variación en la calidad de las muestras de un mismo individuo; esto puede deberse a múltiples factores (días de abstinencia, enfermedades febriles, estrés, etc.).
Otro factor importante a tener en cuenta es el grado de fertilidad de la pareja, que puede variar marcadamente, influyendo de esta manera en los resultados.³⁸
El concepto de poder aumentar el potencial fértil de los pacientes con altos niveles de EO mediante la utilización de antioxidantes fue muy debatido en el pasado y ha ganado considerable atención en los últimos años por el desarrollo de técnicas de reproducción asistida de diversa complejidad.³⁹
Además de afectar los componentes de membrana y su fluidez, la peroxidación inducida de grupos tioles sobre las proteínas alterará la estructura y función de los espermatozoides y del ovocito con una susceptibilidad aumentada al ataque de macrófagos.¹⁸ Asimismo, el estado redox del espermatozoide humano puede afectar la fosforilación de proteínas y la generación de adenosinatrifosfato (ATP) con una marcada influencia sobre el potencial de fertilización.⁴⁰ En general, en condiciones oxidantes, aumenta la fosforilación en tirosina con un mejoramiento de la función espermática, mientras que condiciones reductoras tienen un efecto contrario.⁷
Actualmente la investigación se orienta al estudio de la integridad del ADN nuclear. Su daño puede acelerar el proceso de apoptosis en las células germinales, hecho conocido como "muerte celular programada",⁴¹ que conduce a una declinación en el recuento espermático y su consecuente efecto sobre la fertilidad. Recientes estudios indican un aumento significativo en los niveles de apoptosis en el semen de hombres infértiles.⁴²
Se comprobó que mujeres inseminadas con muestras con alto grado de ADN dañado presentan embriones de pobre calidad y un aumento en la tasa de abortos.⁴³
A su vez el daño oxidativo del ADN mitocondrial (ADNmt) es un tema de creciente interés, ya que tiene lugar en toda célula aeróbica que es rica en mitocondrias, como es el caso de los espermatozoides. Los radicales libres pueden producir deleciones múltiples del ADNmt a nivel de las células espermatogoniales y, como consecuencia de esto, fracasos en la reproducción.⁴⁴
Se considera que la determinación rutinaria del daño al ADN, en prácticas de reproducción asistida, tanto por el método SCSA (medición de la estructura de la cromatina espermática) como por el test COMET, puede jugar un papel muy importante en el manejo de la infertilidad.¹⁹
Asociación entre estrés oxidativo, peroxidación lipídica y anticuerpos antiespermatozides (ASA)
La presencia de ASA en la población infértil varía de acuerdo con la metodología empleada en su investigación. Generalmente se describen valores comprendidos entre 5% y 15%.⁴⁵ La existencia de anticuerpos puede empobrecer la fertilidad,⁴⁶ pero lamentablemente no se conoce el mecanismo por el cual esto se produce. Se han postulado diversas hipótesis para explicar la génesis de ASA:⁴⁶
a) por efecto de ruptura de la barrera hematotesticular que da como resultado la exposición de antígenos inmunogénicos de los espermatozoides;⁴⁷b) por obstrucción mecánica del tracto genital debido a anomalías congénitas, vasectomía o traumas, con la consiguiente extravasación de espermatozoides;^48,49
c) por infección del tracto genital y las glándulas anexas.⁵⁰
Todas estas explicaciones implican un contacto entre el sistema inmune y los antígenos espermáticos para desarrollar de esa manera una respuesta autoinmune.Son aun más complejos los efectos que los ASA producen en el espermatozoide: interferencia en los mecanismos de maduración espermática,⁵¹ bloqueo de la penetración normal de los espermatozoides a través del moco cervical,^52,53 disminución de la movilidad de los gametos,⁵⁴ alteración de la interacción espermatozoide-ovocito.⁵⁵ También se ha sugerido que la presencia de ASA incrementa el colesterol libre de la membrana de los gametos capacitados. De esa manera se impiden los cambios de fluidez necesarios para la expresión de receptores de unión a la zona.⁵⁶
Otro punto importante para destacar está relacionado con los problemas de peroxidación de los ácidos grasos, ya que se determinó que la peroxidación lipídica espontánea produce la pérdida de la movilidad espermática a medida que transcurre el tiempo de incubación de las muestras.^27,57
Como se mencionó anteriormente, el MOST evalúa la pérdida de la movilidad de los gametos masculinos como resultado de la peroxidación lipídica forzada. A través de esta determinación se han podido predecir anormalidades causadas por los espermatozoides en el proceso de fertilización in vitro (FIV).³⁴ Es interesante destacar que se observó una asociación significativa entre los espermatozoides ASA positivos y los valores bajos de MOST de dichas muestras.⁵⁸ Esto pudo correlacionarse con el potencial de fertilización disminuido que presentan los pacientes estudiados.³⁴
En vista de estos hallazgos surgió la hipótesis de que la presencia de ASA podría ser la causa de un MOST anormal, o bien que los bajos valores de MOST en pacientes con ASA positivos podrían ser un epifenómeno dirigido por un mecanismo común en las membranas plasmáticas defectuosas. Con el objeto de estudiar esta hipótesis realizamos determinaciones de MOST y valoración de peroxidación lipídica (test del MDA) como prueba complementaria en presencia o ausencia de ASA. Para ello incubamos espermatozoides de dadores normales (ASA negativos) con sueros conocidos ASA positivos o bien ASA negativos.
A pesar de observarse un aumento significativo en el porcentaje de inmunoglobulinas unidas a los espermatozoides incubados con sueros ASA positivos no se detectaron valores significativamente diferentes de MOST y MDA en estos dos grupos.
Se realizó al mismo tiempo un pequeño experimento adicional en el que los espermatozoides se incubaron en forma similar pero de manera más prolongada (3 horas) para verificar el efecto del tiempo de incubación sobre los resultados. Tampoco en este caso se observaron diferencias significativas entre los grupos. A pesar de la correlación significativa entre valores bajos de MOST y alto porcentaje de ASA, estos datos experimentales parecen refutar la existencia de una relación causal entre ASA y lipoperoxidación anormal (MOST).
No obstante, es importante notar que in vivo los anticuerpos pueden entrar en el tracto genital por diferentes sitios y estar en contacto con los espermatozoides mientras sufren cambios estructurales y funcionales cruciales como los que se producen en el epidídimo. Esto puede conducir a una alteración del sistema redox celular, que en su momento determinará peroxidación y, como consecuencia de ello, su detección a través del MOST.
Como mencionamos anteriormente, ASA positivos y MOST anormal pueden no estar relacionados en forma causal, sino estar unidos por un fenómeno común como es un defecto de la membrana plasmática.
Esto puede conducir a una liberación anormal de antígenos durante la génesis de los espermatozoides o su transporte a través del tracto reproductor, con la consiguiente generación de ASA, así como una maduración anormal de los sistemas de membrana envueltos en la peroxidación lipídica.
Los autores no manifiestan conflictos.

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