Artículo completo
El intercambio Na+/Ca2+ de células animales
El calcio iónico intracelular desempeña una función central en la cascada de señales actuando como segundo mensajero. Así, durante la activación celular, se produce un aumento rápido y transitorio de la concentración citoplasmática de calcio iónico que en algunos casos puede pasar de 0.01-0.1 μM en reposo a 10-300 μM. Las células poseen mecanismos específicos para remover Ca2+ desde el citosol, entre los que se encuentra el intercambiador Na+/Ca2+. Debido a su alta capacidad de transporte, este mecanismo cumple un papel fundamental allí donde tienen lugar cambios importantes de la concentración de calcio iónico intracelular [Ca2+]i tales como las sinapsis nerviosas y en la región subsarcolemar de células cardíacas.
En la mayoría de los tejidos de origen animal, tanto en vertebrados como en invertebrados, se identificaron intercambiadores Na+/Ca2+.1-3 En general, movilizan Ca2+ en una dirección a través de la membrana plasmática en intercambio por 3 o 4 Na+ que se mueven en dirección opuesta.4,5 El primer intercambiador Na+/Ca2+ fue clonado en 1990 a partir de corazón de perro.6 Desde entonces se determinó que los transportadores Na+/Ca2+ de mamífero comprenden una familia multigénica de proteínas con tres isoformas NCX1,6,7 NCX28 y NCX3,9 que comparten entre sí 68% a 75% de homologia. Su distribución es diferente según el tipo de tejido: NCX1 es expresado en mayor proporción en músculo cardíaco y en menor proporción en riñón, retina, cerebro y músculo; en cambio, NCX2 y NCX3 están presentes principalmente en cerebro y músculo esquelético.10 En invertebrados, dentro de la familia NCX se clonaron al menos tres transportadores: uno, presente en nervio de calamar (NCXQ1);11 otro, de Drosophila (Calx),12 y un tercero, de C. Elegans.12
La topología de los transportadores de la familia NCX pudo determinarse por análisis de hidropatía, accesibilidad de cisteínas y marcado de epitopes. Estas proteínas tienen 9 segmentos transmembrana (STM) agrupados en dos partes separadas por una gran asa citoplasmática hidrofílica ubicada entre los STM5 y STM6. Cada una de estas dos regiones presenta alta homología intramolecular y está orientada hacia lados opuestos de la membrana.13 El asa citosólica central de la molécula abarca más de la mitad de la proteína y en ella se ubican sitios que tienen relación con la regulación de la actividad del intercambiador.1,14-17
Activación metabólica del intercambio Na+/Ca2+ por Mg-ATP en diferentes tejidos y especies
Muchos transportadores y canales iónicos presentan mecanismos de regulación dependientes de ATP.18 La regulación de la función de proteínas por fosforilación reversible es reconocida como un mecanismo clave en el control de muchos procesos celulares. Así, existen evidencias de que el Mg-ATP estimula el contratransporte Na+/Ca2+ tanto en axón de calamar19 como en diferentes preparaciones de miocardio;20-22 y aunque esta estimulación es importante, el ATP no es un requerimiento esencial para la actividad. En todas las preparaciones, el Mg2+ intracelular es un requerimiento absoluto, lo cual indica que el nucleótido actúa mediante eventos de fosforilación, aunque el mecanismo involucrado parece ser diferente entre especies y también según el tejido, aun en la misma especie.
Recientemente, Di Polo y Beaugé,23 presentaron una recopilación de la información sobre las similitudes y diferencias en la regulación por ATP del intercambio Na+/Ca2+ basados en estudios realizados en los dos modelos experimentales: corazón de mamífero y nervio de calamar. En ambos sistemas el contratransporte tiene características comunes entre las cuales se destacan: (1) es imprescindible la unión de Ca2+ a un sitio intracelular regulador para la funcion, (2) el Mg-ATP estimula el transporte e induce marcado incremento en la afinidad del sitio regulatorio para Ca2+; (3) los efectos del Mg-ATP son pequeños o nulos en ausencia de Na+ citosólico. Entre las diferencias podemos decir que la estimulación del intercambio por Mg-ATP en nervio de calamar requiere la presencia de un factor citosólico proteico de alrededor de 13 kD.24 Ninguno de los inhibidores de quinasas (treonina y serina) o fosfatasas conocidos modifica el efecto de MgATP. Sin embargo, es sensible a la acción de fosfatasas inespecíficas, lo que sugiere la participación de un sistema de quinasa(s)-fosfatasa(s). En axón de calamar observamos un efecto estimulador de otro fosfágeno: fosfoarginina (PA), presente en concentraciones milimolares.25 Haciendo un paralelo con vertebrados, este fosfágeno equivale a fosfocreatina, aunque en este caso, éste no es capaz de estimular el intercambiador de corazón bovino.26 En sarcolema cardíaco, la estimulación por Mg-ATP es eliminada por fosfolipasa C específica para fosfoinosítidos (PtdIns-PLC) y es reestablecida por la adición exógena de PtdIns y MgATP o directamente de PtdIns4,5-P2 (ver1,16,17,22,23,26-28). En nuestro laboratorio demostramos que la activación tiene lugar a través de la síntesis rápida de PtdIns4,5-P2 a partir de Mg-ATP y PtdIns4,-P21 y que el NCX1 existe en una forma que une PtdIns4,5-P2 y que las modificaciones por ATP de su actividad ocurren en paralelo a los cambios en la cantidad de PtdIns4,5-P2 unido al mismo.29
El intercambiador de cerebro bovino
Las diferencias observadas entre los intercambiadores Na+/Ca2+ de células nerviosas de calamar y corazón de mamíferos pueden tener más de un origen. Pueden representar diferencias de tejidos, de especies o de ambos, o pueden obedecer a diferencias en la fuerza iónica, en la osmolaridad o en ambas, utilizadas en la obtención o medición de los flujos de los distintos intercambiadores.
Con la finalidad de caracterizar los efectos de Mg-ATP en el intercambiador de cerebro bovino, estudiamos el contratransporte Na+/Ca2+ en vesículas de membrana plasmática de cerebro bovino y esos datos pudieron compararse con los obtenidos utilizando otras fuentes de la proteína (sarcolema cardíaco y nervio de calamar). Midiendo la captación de [45Ca]Ca dependiente del gradiente de sodio, observamos que en vesículas de cerebro bovino y a concentraciones submáximas del ión Ca2+ (micromolar), el Mg-ATP produce un incremento de 2 a 3 veces del intercambio Na+/Ca2+, que pasa de 0.33 ± 0.02 nmol/mg.20s a 1.1 ± 0.07 nmol/mg.20s (n= 6) sin necesidad de la adición de un factor citosólico (por detalles, ver referencias26,29).
Como mencionamos antes, en los transportadores de nervio de calamar y corazón bovino el Mg-ATP estimula a través de incrementar la afinidad aparente por Ca2+ citosólico (aproximadamente 10 veces). Así, a concentraciones de Ca2+ saturantes no se observa efecto del nucleótido. En cerebro bovino, el incremento en la afinidad para [Ca2+]i en presencia de 1 mM ATP es de alrededor de 4 veces (el K0.5 para Ca2+ pasa de 0.48 μM a 0.11 μM) pero, a diferencia de los precedentes, un pequeño pero significativo incremento persiste aún a [Ca2+]i saturante (100 μM). En cuanto a la Km aparente para la activación por ATP del intercambio en cerebro bovino, se determinó como 336 μM a 1 μM de Ca2+, la que está en el orden de las observadas para corazón de la misma especie (500 μM) y nervio de calamar (200 μM). Por otra parte, la activación por ATP fue independiente de la fuerza iónica del medio de preparación de las vesículas y del utilizado en la medición de los flujos, observándose efectos semejantes tanto a la fuerza iónica normal para mamíferos (160 mM) como la correspondiente a invertebrados marinos (300 mM), observación que deja de lado la posibilidad de que alta fuerza iónica colabore liberando de la membrana de nervio de calamar el factor citosólico necesario para que ATP actúe, y por ende apoya la idea de la participación de vías diferentes, en cerebro bovino y cerebro de calamar, para el mecanismo de activación del intercambiador por Mg-ATP.
Un dato adicional en esta comparación es que al igual que en corazón de la misma especie y a diferencia del nervio de calamar, el efecto de ATP en cerebro bovino es anulado por acción de una fosfolipasa polifosfoinosítido sensitiva (PtdIns-PLC) y este efecto es reconstituido por el agregado exógeno de PtdIns-4,5-P2. Por otra parte observamos, en ausencia de ATP, incremento en la captación de Ca2+ dependiente del gradiente de Na+ con el agregado de PtdIns-4-P, y este efecto se magnifica en presencia de 1 mM ATP. El efecto observado con PtdIns-4,5-P2, por el contrario, no fue modificado por ATP.
Por último, analizando los efectos de fosfoarginina (fosfágeno natural del calamar) y fosfocreatina (análogo en función a fosfoarginina, en los mamíferos) en el intercambio Na+/Ca2+ de cerebro bovino observamos que estos fosfágenos no estimulan este sistema, tal como sucede en corazón bovino y diferente de nervio de calamar.
En su conjunto estos resultados señalan que la modulación del intercambio Na+/Ca2+ por Mg-ATP en membranas plasmáticas de cerebro bovino es más comparable a la observada en membranas de sarcolema cardíaco de la misma especie que a la correspondiente de nervio de calamar, lo que aporta nuevas evidencias a favor de la existencia de mecanismos de regulación distintos entre especies, aunque procedan de tejidos con funciones fisiológicas similares. Por otro lado, el hecho de que los intercambiadores de cerebro y corazón bovino respondan con ligeras diferencias a la regulación metabólica por ATP puede guardar relación con las características individuales de las isoformas presentes en cada tejido, ya que NCX1 es la única isoforma presente en corazón, mientras que en cerebro, si bien NCX1 es mayoritaria, también están presentes las isoformas NCX2 y NCX3 (por referencias ver1,2).
Los autores no manifiestan conflictos.