NUEVOS MARCADORES MICROBIOLOGICOS DE LA HEPATITIS C

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Introducción

Según la Organización Mundial de la Salud, la hepatitis C afecta al 2% de la población mundial, aunque la distribución no es uniforme en función de la geografía; así, mientras que en Europa y en América se calcula que entre el 1% y el 1.9% de sus habitantes están infectados, en algunos países de Africa, este porcentaje se eleva al 9% de la población.¹

La aplicación, análisis e interpretación de los resultados aportados por las nuevas técnicas microbiológicas es una de las líneas de investigación más importantes que actualmente se llevan a cabo para el mejor conocimiento de la infección humana por el virus de la hepatitis C (VHC). La aplicación en este campo de las nuevas herramientas de la biología molecular proporciona datos útiles en el diagnóstico, tratamiento y control de este patógeno y en esta revisión pretendemos realizar una actualización de los datos más novedosos sobre este tema.

Genotipos de la hepatitis C

La prevalencia de los diferentes genotipos del VHC depende del área geográfica, los genotipos 1a y 1b son los más prevalentes en Estados Unidos y en buena parte de Europa, mientras que el genotipo 2 es infrecuente en España. El genotipo 4 fue identificado en EE.UU., Oriente Medio y Africa,² y los genotipos 5 y 6 en Sudáfrica y en Hong Kong, respectivamente³. En Iberoamérica, el genotipo 1 es el más prevalente; así, en Brasil el genotipo 1 es el responsable de la infección de más del 50% de los casos, mientras que el genotipo 3 ocupa el segundo lugar, con menos de 40% de los casos.^4-6 La prevalencia del genotipo 1 es aun más alta en Chile, ya que se sabe que el 1b infecta al 82% de los pacientes.⁷

La distribución de los genotipos en una población es un fenómeno complejo y dinámico a lo largo del tiempo. Un estudio realizado durante 13 años en Francia muestra que los genotipos más frecuentes son el 1b (30.2%), 1a (27.7%) y 3a (22.4%), y que los genotipos 1a, 1b, 3a y 4a presentan un perfil epidémico con un gran número de aislamientos por subtipo, mientras que los del tipo 2 presentan un perfil endémico con muchos subtipos y pocos aislamientos de cada uno.⁸ Además, a lo largo del estudio, el perfil cambió radicalmente influido por la etiología de la infección; se observa la aparición de nuevos subtipos epidémicos asociados al uso de drogas por vía parenteral (1a y 3) y la desaparición de los tipos asociados a transfusiones de sangre y a infección nosocomial (1b y 2).⁸

Además, al estudiar la región 5’UTR (untranslated region), muy conservada, se encontraron diferencias entre los virus presentes en plasma y en leucocitos de sangre periférica de algunos pacientes (9%); así, el genotipo detectado en leucocitos no está presente en el plasma y, en algunos casos, tampoco en el hígado; este fenómeno puede deberse a sobreinfecciones.⁹

La presencia de un determinado genotipo tiene gran importancia clínica, ya que un análisis de 6 807 pacientes mostró que los hombres presentan mayor carga viral respecto de las mujeres, al igual que los infectados por el genotipo 1 respecto de los infectados por los genotipos 2 y 31.¹⁰ Por otra parte, se comprobó que los pacientes infectados por el genotipo 4 tienen una carga viral menor que los infectados con el resto de los genotipos,^11,12 mientras que sucede lo contrario con los enfermos del genotipo 3a. También se comunicó que los pacientes coinfectados por el VIH presentan mayor carga viral en todos los genotipos y mayor riesgo de progresión a mortalidad asociada al sida, sobre todo los enfermos infectados por más de un genotipo.^13-15

También se asocian el genotipo y el período de ventana; en donantes de sangre se describe este fenómeno en 18.5 casos por millón, aunque es mucho más frecuente en enfermos infectados por los genotipos 4 y 3a, al contrario de lo que sucede en los infectados por el subtipo 1b.¹⁶

Es bien sabido que algunos genotipos responden mejor a los tratamientos, aunque se desconoce la causa de este fenómeno se postuló la implicación de la respuesta específica de células T frente a NS3 como un fenómeno asociado a una eliminación más rápida del ARN viral.¹⁷

Para la determinación de este parámetro existen distintas metodologías con diversa sensibilidad (entre 64.3% y 100%) y especificidad (entre 42.7% y 85.7%). Las técnicas más novedosas se basan en la secuenciación de las regiones NS5b y 5’ NC; la espectrometría de masas, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real y la metodología denominada HMA (heteroduplex mobility análisis).^13,18-20

Detección del antígeno del core viral

Recientemente se desarrolló la detección del antígeno del core viral en el suero de los pacientes con infección por VHC.¹⁸ Esta técnica se muestra útil en el cribado de los pacientes y en la detección de casos de primoinfección en ausencia de anticuerpos,^19,20 con elevada sensibilidad (97%) y especificidad (100%) y una buena correlación con la PCR.^21,22

También se utiliza con éxito para predecir la respuesta al tratamiento antiviral; en la detección de pacientes sin respuesta al tratamiento presenta un valor predictivo negativo del 75% a la semana 4 y un valor del 100% a la semana 12.^23,24

Hay correlación entre los valores de este marcador y el ARN viral. Así, 9 900 UI/ml corresponden a 1 pg/ml de antígeno del core viral. Se descubre la presencia del antígeno en el 92% de los enfermos con ARN viral detectable por PCR > 600 UI/ml, siendo casi siempre positivo si la carga viral es mayor de 20 000 UI/ml.²⁵ Sin embargo, también se ha descrito la falta de correlación en algunos pacientes, lo que puede estar asociado a la existencia de partículas virales sin genoma; estas partículas están en enfermos con respuesta bioquímica prolongada.²⁶

Un metaanálisis muestra que esta técnica, al igual que la PCR, identifica la presencia de infección más tempranamente que la detección de anticuerpos (entre 40 y 50 días), tiene utilidad en la monitorización del tratamiento independientemente del genotipo viral, pero debido a la menor sensibilidad que la PCR presenta limitaciones a la hora de determinar la respuesta viral sostenida.²⁷

Los nuevos métodos serológicos que realizan detecciones simultáneas de anticuerpos y antígenos son muy útiles a la hora de diagnosticar las infecciones agudas, ya que disminuyen el período de ventana y pueden ser una alternativa a la PCR.²⁸

Técnicas de amplificación genómica

Mediante esta metodología se observó que para cada genotipo existen pacientes con respuesta rápida y con respuesta lenta. Los primeros presentan una mayor caída de la carga viral en la cuarta semana postratamiento y responden mejor a la terapia.²⁹

Los pacientes con respuesta rápida presentan una disminución del ARN viral de 3 log₁₀ durante la primera semana, mientras que la no disminución a la semana 12 se asocia con falta de respuesta.³⁰

También es muy útil en el diagnóstico de la infección de algunos pacientes, por ejemplo en los enfermos hemodializados con síndrome de malnutrición-inflamación y caquexia, en los que se vio que en muchas ocasiones no se detecta la presencia de anticuerpos.³¹ En general, en los pacientes hemodializados, la seroconversión puede retrasarse de 3 a 16 meses.³²

Tras la infección se produce un crecimiento exponencial del número de virus, doblándose la carga viral cada 10.8 horas. Como media, puede detectarse viremia intermitente durante los primeros 56 días, observándose un incremento de la viremia en la etapa previa a la seroconversión.³³

Recientemente se describió el fenómeno de la hepatitis C oculta, caracterizada por la existencia de ARN viral en hígado en ausencia de anticuerpos y ARN viral en suero; más del 70% de los pacientes presentan ARN viral en células mononucleares de sangre periférica. Estos pacientes podrían ser potencialmente infecciosos, por lo que se deben modificar las técnicas actuales para su correcta detección.³⁴

Reactividad específica de las células T

Este nuevo marcador ayuda a diferenciar subgrupos dentro del mismo genotipo, ya que sólo los considerados como de respuesta rápida presentan un incremento de este marcador después de la pérdida de la viremia.²⁹

Desarrollo de chips proteicos

Esta nueva metodología permite determinar simultáneamente la presencia de diferentes anticuerpos. Los primeros estudios muestra mayor sensibilidad y especificidad que el ELISA y sus datos son concordantes con los aportados por el RIBA, considerada la técnica de referencia.³⁵

Detección de anticuerpos en saliva

Existen estudios que demuestran que la detección de anticuerpos en saliva tiene buena sensibilidad si el paciente presenta carga viral positiva en suero.³⁶

Detección de resistencias a fármacos

Se están desarrollando marcadores microbiológicos que tratan de predecir la respuesta a los tratamientos antirretrovirales. Los métodos de secuenciación son los más empleados y hasta el momento los datos más importantes son:

- Los enfermos con buena respuesta presentan más mutaciones en la región V3 de NS5A.³⁷

- La mutación en la región no estructural de la proteasa 3/4ª limita el reconocimiento de los virus por los leucocitos, escapando de la acción citotóxica de los linfocitos T y provocando persistencia viral.³⁸

La secuenciación de la región NS5B, que codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN, revela que mutaciones en las posiciones 300-358 tienen lugar más frecuentemente en enfermos con respuesta sostenida, sobre todo en los aminoácidos 309, 333, 338 y 355.³⁹

El análisis del genoma completo de virus con genotipo 2b muestra que el porcentaje de aminoácidos sustituidos es mayor en los enfermos con respuesta, sobre todo en NS4A.⁴⁰

Varias publicaciones y un metaanálisis indican que las mutaciones en la región ISDR (interferon sensitivity-determining region) de la región no estructural 5A (NS5A) se correlaciona con la respuesta a este compuesto, asociándose a la supresión de la replicación viral y a la protección del hepatocito de la apoptosis.^41-44

Descenso de la metaloproteína de matriz 9 (MM-9)

Se observó que los niveles de esta proteína vírica descienden al final del tratamiento si el paciente presenta respuesta virológica sostenida, tanto en suero como en el hígado, mientras que se mantienen en aquellos sin respuesta.⁴⁵

Quasiespecies

La infección por este virus puede iniciarse a partir de múltiples partículas infecciosas con componente genético heterogéneo (en un tercio de los pacientes) o a partir de una única partícula que conduce a una infección clonal inicial.²⁶ Además de este fenómeno, por las características propias del virus se produce una diversidad genética a lo largo del tiempo.

Esta diversidad genética ya es conocida a través de los múltiples tipos y subtipos descritos, pero recientemente se desarrollaron métodos microbiológicos capaces de estudiar variaciones más sutiles dentro del virus, denominadas cuasiespecies. Este hecho tiene una importante repercusión a la hora de estudiar la resistencia viral a los fármacos, ya que un estudio muestra que al analizar la región NS5A mediante secuenciación se observa que, antes del tratamiento, la complejidad y diversidad de cuasiespecies es menor en aislamientos de pacientes con buena respuesta, sobre todo en el dominio V3. Estas diferencias se hacen mayores durante el tratamiento, ya que la diversidad tiende a incrementarse en los pacientes sin respuesta, mientras que disminuye en los que respondedn.^46,47

Epidemiología molecular

El desarrollo de métodos microbiológicos capaces de comparar los genomas víricos entre sí aporta herramientas que ayudan a conocer la transmisión, basadas principalmente en la secuenciación de diversas regiones del genoma vírico.⁴⁸ Se ha intorducido en el mercado un producto que analiza la región NS5b (Trugene NS5b HCV), con buenos resultados.⁴⁹

Futuro

En los últimos años se avanzó mucho en el estudio microbiológico del virus de la hepatitis C, aunque quedan aún muchos retos. El mejor diagnóstico de la enfermedad y el desarrollo de pruebas microbiológicas que puedan predecir la respuesta al tratamiento son probablemente las dos necesidades más acuciantes. Para avanzar en este camino se están realizado importantes esfuerzos; cabe destacar la creación de grandes bases de datos internacionales en las que los diversos investigadores depositan las secuencias de muchos miles de virus. Así, hay depositadas más de 30 000 secuencias en las bases DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL) and GenBank.^50-51

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