IDENTIFICAN PROTEINAS ESPERMATICAS INVOLUCRADAS EN LA FECUNDACION HUMANA

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Introducción

La fecundación es un fenómeno complejo que involucra la interacción entre los gametos masculino y femenino. El espermatozoide, una célula sumamente especializada, es producida en el testículo, sufre un proceso de maduración durante su estadía en el epidídimo y completa la adquisición de su capacidad fecundante en el tracto femenino, mediante un proceso conocido como capacitación espermática. Una vez capacitado, el espermatozoide puede unirse a la matriz extracelular del ovocito o zona pelúcida (ZP), interacción que desencadena la exocitosis del contenido acrosomal (exocitosis acrosomal). La liberación de las enzimas acrosomales, junto con la movilidad hiperactivada, permiten que el espermatozoide penetre la ZP y se fusione con la membrana plasmática del ovocito u oolema.¹

El reconocimiento e interacción de los gametos se basa en la complementariedad de los componentes de la ZP y de las moléculas presentes en la membrana plasmática del espermatozoide. La unión espermatozoide-ZP es específica de especie y la exocitosis acrosomal se desencadena cuando ligandos de la matriz extracelular del ovocito provocan la agregación de receptores en el espermatozoide. A pesar de que numerosos estudios se orientaron a la caracterización de las moléculas espermáticas involucradas en estos eventos, aun no se determinó con certeza la identidad de éstas.² Se ha propuesto que en la superficie del espermatozoide podría existir un receptor de ZP multivalente (con más de un sitio activo), o varios sitios receptores, que contribuirían a la especificidad y complejidad en la interacción de los gametos.³

El proceso de fecundación puede ser afectado por la presencia de anticuerpos dirigidos contra antígenos espermáticos u ovocitarios. Estos anticuerpos (inmunoglobulinas de los tipos A, G y M) fueron detectados en el suero y en secreciones del tracto reproductor masculino (plasma seminal) y femenino (moco cervical, fluidos folicular y tubario). Se ha descrito que la infertilidad por causa inmunológica afecta de un 9% a un 36% de las parejas en consulta médica por dificultades para concebir.^4,5

Los anticuerpos antiespermáticos pueden interferir en la movilidad y en la penetración de los espermatozoides a través del moco cervical, así como afectar la interacción de los gametos y el desarrollo embrionario temprano.^6,7 Estudios previos de nuestro grupo indicaron que los fluidos foliculares (FF) provenientes de pacientes participantes de un programa de fecundación asistida contienen inmunoglobulinas de tipo G (IgG) capaces de inducir la exocitosis acrosomal de los espermatozoides humanos;⁸ un análisis individual permitió identificar fluidos con IgG que, además de desencadenar la exocitosis del acrosoma, inhiben la unión de los espermatozoides a la ZP.⁹ Teniendo en cuenta el efecto de estos anticuerpos sobre la funcionalidad del espermatozoide, es posible proponer que éstos estén dirigidos contra entidades espermáticas que participan en la interacción con el ovocito. El objetivo del presente trabajo fue utilizar estas IgG del FF como herramientas para avanzar en la identificación de proteínas espermáticas involucradas en eventos tempranos de la fecundación humana.

Materiales y métodos

Las muestras de semen humano utilizadas en el presente estudio fueron obtenidas con el consentimiento informado de los donantes y el protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (Buenos Aires, Argentina).

Obtención y procesamiento de las muestras de semen

Las muestras de semen fueron obtenidas de donantes voluntarios, luego de 2 a 5 días de abstinencia sexual. Dentro de la primera hora de obtención de las muestras se determinaron los parámetros seminales de acuerdo con los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud.¹⁰ Sólo se utilizaron las muestras de semen que presentaron una concentración de 20 x 10⁶ espermatozoides/ml o mayor, con más de 50% de espermatozoides con movilidad progresiva, un porcentaje de formas normales mayor del 14% y que carecían de anticuerpos antiespermáticos, según el análisis por el ensayo de Immunobeads directo.¹⁰

Los espermatozoides móviles fueron seleccionados por filtración por columnas de lana de vidrio y la capacitación espermática se llevó a cabo por incubación a 37°C, durante 6 h en medio HSM suplementado con 26 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.).¹¹ Luego de esta incubación, se determinó el porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva, descartándose aquellas muestras que presentaban menos de 75% de células móviles.

Obtención y preparación del fluido folicular humano

Las muestras de fluido folicular se obtuvieron de pacientes participantes en un programa de fecundación in vitro (Centro Médico Fertilab, Buenos Aires), sin realizar una selección previa de acuerdo con la causa de infertilidad.

El desarrollo folicular múltiple se obtuvo utilizando un protocolo largo de inducción con análogos de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH, LUPRON, Lab. Abbot) y gonadotrofinas recombinantes (GONAL, Serono, Buenos Aires, Argentina).¹² Los folículos fueron aspirados mediante ecográfica transvaginal; los complejos cumulus oophorus-ovocito fueron transferidos a cápsulas de cultivo y los fluidos foliculares correspondientes a cada paciente fueron centrifugados durante 15 min a 1500 xg para eliminar los restos celulares, calentados a 56°C, filtrados y posteriormente almacenados a -20°C hasta su utilización.

Extracción, separación electroforética y electrotransferencia de las proteínas espermáticas

Los espermatozoides, luego de la incubación en condiciones que promueven la capacitación, fueron lavados 2 veces con buffer fosfato salino (PBS; pH 7.4), conteniendo p-aminobenzamidina 1 mM y resuspendidos en buffer de extracción (Tritón X-100 1% y desoxicolato de Na⁺ 1% en PBS suplementado con inhibidores de proteasas: p-aminobenzamidina 2 mM, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) 1 mM, aprotinina 10 μg/ml y leupeptina 10 μg/ml). La extracción proteica se llevó a cabo por incubación en hielo durante 2 h con agitación; posteriormente las muestras se trataron con ultrasonido durante 10 min y se centrifugaron a 6 000 xg por 5 min.¹³ Los sobrenadantes fueron suplementados con buffer “muestra” de Laemmli 4x y fueron calentados a 100(C en presencia de beta-mercaptoetanol 70 mM durante 5 min.¹⁴ Después de una centrifugación, los sobrenadantes fueron guardados a -20(C hasta su uso. Los extractos proteicos provenientes de 7 donantes diferentes fueron mezclados y sometidos a separación electroforética.

Se utilizaron geles preparativos de poliacrilamida al 10% y SDS 0.1%, preparados siguiendo la técnica de Laemmli.¹⁴ Se sembraron alícuotas de los extractos proteicos correspondientes a 300 x 10⁶ espermatozoides, paralelamente con los estándares de peso molecular (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) y la corrida electroforética se realizó a corriente constante (25 mA por gel). La transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa fue realizada de acuerdo con el método de Towbin y col.,¹⁵ a un voltaje constante de 35 V, por 18 h a 4(C. Las membranas fueron teñidas con rojo Ponceau (2 mg/ml en ácido acético 0.5%) hasta obtener la coloración deseada y posteriormente fueron cortadas en secciones a lo largo del sentido del desarrollo de la electroforesis.

Inmunodetección

Los sitios de unión no específicos de la membrana de nitrocelulosa fueron bloqueados por incubación con leche descremada 5% en PBS-Tween 20 0.1% durante 1 h. Posteriormente, cada sección de nitrocelulosa fue incubada con los fluidos foliculares individuales (diluidos 1:25 en solución de bloqueo), durante toda la noche a 4ºC. Luego de 4 lavados de 5 min con PBS-Tween 20 0.1%, se agregó el segundo anticuerpo (anti-IgG humana desarrollado en conejo, unido a peroxidasa, Sigma Chemical Co.) diluido 1:5 000, incubándose por 1 h. La nitrocelulosa se lavó como se indicó anteriormente y las bandas reactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia (ECL kit, Amersham Life Science Inc., Oakville, ON, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente.

La determinación de los pesos moleculares aparentes se llevó a cabo mediante interpolación en la recta obtenida por regresión lineal, utilizando los valores de movilidad electroforética en función del peso molecular de los estándares de proteínas.

Resultados

En un estudio anterior, nuestro grupo describió que inmunoglobulinas presentes en los fluidos foliculares (IgGFF) de pacientes en tratamiento por infertilidad son capaces de inducir la exocitosis acrosomal en espermatozoides humanos; en el mismo estudio se determinó que cuando las incubaciones se realizaron en condiciones que previenen la inducción de la exocitosis acrosomal (en medio de capacitación conteniendo iones Sr²⁺ en reemplazo de iones Ca²⁺),¹¹ la presencia de estas inmunoglobulinas conducía una disminución en la capacidad de los espermatozoides de unirse a la ZP homóloga.⁹ Estos resultados indicarían que algunas IgGFF son capaces de reconocer y producir la agregación de receptores espermáticos para la ZP, y por lo tanto, se constituyen en herramientas valiosas para la identificación y caracterización de entidades espermáticas que participan en la interacción de los gametos humanos.

En el presente estudio se llevaron a cabo ensayos de Western immunoblotting a fin de identificar las proteínas espermáticas reconocidas por las IgGFF analizadas en el trabajo anterior. Los extractos de proteínas se prepararon utilizando espermatozoides incubados en condiciones que promueven la capacitación. Los componentes proteicos extraídos fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida, seguida de electrotransferencia e inmunorrevelado con FF individuales conteniendo IgG previamente seleccionados por su alta capacidad de inducir la exocitosis acrosomal, que inhiben o no afectan la unión de los espermatozoides a la ZP (clasificadas como Grupo III).⁹ Como control se utilizaron FF con IgG con capacidad baja o nula de provocar la liberación de las enzimas acrosomales, que no bloquean la interacción de los gametos (Grupo I).⁹ En los ensayos se incluyeron 6 fluidos del Grupo III y 7 del Grupo I, seleccionados al azar.

El análisis del patrón de bandas mostró que cada inmunoglobulina elegida reconoció de manera específica entre 5 y 10 proteínas espermáticas con peso molecular aparente (PM) entre 130 y 11 kDa (figura 1, tabla I). A fin de identificar las proteínas detectadas por las IgGFF con capacidad de afectar la funcionalidad espermática se siguieron varias estrategias de análisis. En una de ellas se procedió a la búsqueda de bandas inmunorreactivas para alguna de las IgGFF del Grupo III que no estuvieran presentes en los perfiles inmunorrevelados con IgGFF del Grupo I; en este caso, se discriminó entre las IgGFF del Grupo III con capacidad de inducir la exocitosis acrosomal e inhibir la unión de los espermatozoides a la ZP (IgGFF # 7, 14, 26 y 28) y las IgGFF del Grupo III sólo inductoras de la exocitosis acrosomal (IgGFF # 25 y 32). Como resultado de esta búsqueda se identificaron tres bandas inmunorreactivas específicas: una de 78 ± 1 kDa, reconocida por la IgGFF # 7, una de 15 ± 1 kDa, reconocida por la IgGFF # 26 y una de 58 ± 2 kDa, detectada por la IgGFF # 32. Estas proteínas no fueron reactivas con otras de las IgGFF evaluadas (figura 1 y tabla I).

Figura 1. Proteínas espermáticas reconocidas por inmunoglobulinas del fluido folicular. Los espermatozoides móviles fueron incubados en condiciones que promueven la capacitación por 6 h, en medio HSM, y las proteínas fueron extraídas utilizando un buffer con detergentes. Se realizaron geles preparativos (desnaturalizantes) y se sembró una alícuota del extracto correspondiente a 300 x 10⁶ espermatozoides. Luego de la transferencia, la membrana de nitrocelulosa fue dividida en secciones a lo largo del sentido del desarrollo de la electroforesis, que fueron incubadas con los fluidos foliculares individuales como primer anticuerpo y anti-IgG humana como segundo anticuerpo. Como control, una sección fue incubada solamente con segundo anticuerpo (2do). Los marcadores de peso molecular (x 10^-3) se indican en el margen izquierdo de la figura. Se muestran los resultados de un experimento típico. El ensayo fue repetido tres veces obteniéndose resultados similares. Los asteriscos indican bandas reconocidas selectivamente por IgGFF del Grupo III (con alta capacidad de inducir la exocitosis acrosomal).⁹

tabla I

Discusión

Los anticuerpos presentes en los fluidos de hombres y mujeres inmunoinfértiles han sido ampliamente usados para la identificación de proteínas que participan en los distintos eventos del proceso de fecundación. Mediante diferentes técnicas como Western immunoblotting, inmunoprecipitación, análisis de bibliotecas de ADN complementario o evaluación proteómica avanzada en combinación con anticuerpos provenientes de fluidos de pacientes inmunoinfértiles o anticuerpos monoclonales, se describieron, entre otras, las proteínas espermáticas LDH-C4, HSA-63, CS-1, SP 1U, SAGA-1, YWK-II, BE-20, rSMP-B, BS-63, BS-17, HED-2, GNPDA, SP22, Ag 1F10, PH-20, FA-1, FA-2, gp20, NASP, TSA-1, SP-10, NZ-1, NZ-2, SPAN-X, AgX-1, CV, CABYR, SAMP14, SAMP32, SP-17, SPAG9, etc.; la mayor parte de estos estudios se basaron en una caracterización inicial bioquímica o molecular o de ambos tipos, y en el análisis posterior de la relevancia funcional de las proteínas de interés (para revisión, véanse referencias 16-19).

En el presente estudio, los fluidos foliculares que contenían anticuerpos de importancia funcional por su capacidad de inhibir la unión de los espermatozoides a la ZP y su efecto inductor de la exocitosis acrosomal⁹ fueron utilizados para la identificación de proteínas espermáticas involucradas en la interacción con el ovocito. En el análisis por Western immunoblotting, las IgGFF reconocieron un conjunto de proteínas espermáticas de variados PM. Una complejidad similar fue descrita en los perfiles de proteínas reactivas a inmunoglobulinas del suero de pacientes inmunoinfértiles,^20-24 resultados que sugieren que la infertilidad de tipo inmunológica sería la consecuencia de la acción combinada de diferentes anticuerpos sobre antígenos espermáticos múltiples.

La estrategia de análisis del presente estudio se basó en la comparación de las proteínas inmunorreactivas a las IgGFF con capacidad de afectar la funcionalidad espermática (Grupo III) respecto de las detectadas por las IgGFF del grupo control (Grupo I). La búsqueda de entidades reconocidas específicamente por las IgGFF del Grupo III condujo a la identificación de tres bandas de 78 ± 1, 58 ± 2 y 15 ± 1 kDa. Si se considera el efecto biológico de las IgGFF determinado en el trabajo previo,⁹ se podría proponer la participación de las proteínas espermáticas de 78 ± 1 y 15 ± 1 kDa tanto en la unión a la ZP como en la inducción de la exocitosis acrosomal, mientras que la proteína de 58 ± 2 kDa podría estar involucrada sólo en la inducción de la exocitosis del contenido acrosomal.

La revisión de la literatura indica que existen varios informes sobre la identificación de proteínas espermáticas de PM similar a las encontradas en el presente estudio. Proteínas de PM cercano a 78 kDa fueron descritas en estudios que usaron anticuerpos del suero de mujeres^25-27 y hombres infértiles,^28,29 así como anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas de espermatozoides humanos.^30,31 Entidades espermáticas de un PM similar a 58 kDa fueron identificadas luego de la comparación de los perfiles proteicos de espermatozoides provenientes de muestras con parámetros seminales normales y las correspondientes a hombres infértiles³² y mediante el uso de inmunoglobulinas presentes en fluidos de pacientes inmunoinfértiles^{20,21,23,29,33-39} o de anticuerpos monoclonales³¹ o policlonales desarrollados contra espermatozoides y plasma seminal.⁴⁰ En particular, una de las proteínas espermáticas mejor caracterizadas como receptor para la ZP en humanos es la denominada FA-1, de 51 kDa.^41,42 Con respecto a proteínas de alrededor de 15 kDa, éstas también fueron reconocidas por anticuerpos presentes en fluidos de pacientes inmunoinfértiles.^38,43-45 Entre ellas figuran los antígenos denominados CS-1,⁴⁶ BS-17,⁴⁷ y P18,⁴⁸ así como SAGA-1 y SOB2-SOB3 que fueron identificados por anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas de espermatozoides humanos.^49-51 Cabe mencionar que proteínas espermáticas de PM entre 14 y 18 kDa son reconocidas por componentes de la ZP, lo que sugeriría su participación en la interacción de los gametos.^52,53

Durante el análisis no se detectaron bandas inmunorreactivas a todas IgGFF del Grupo III evaluadas. Esto podría explicarse por el hecho de que estos anticuerpos, capaces de reconocer antígenos que se localizan sobre la superficie del espermatozoide en su conformación nativa no sean reactivos contra las proteínas espermáticas luego del tratamiento al que fueron sometidas para el ensayo de immunoblotting. Por otra parte, si se considera que se propuso que la interacción espermatozoide-ZP requeriría la participación de más de un sitio receptor en la superficie espermática,³ es posible que las IgG de distintos fluidos foliculares reconozcan diferentes proteínas, todas involucradas en este evento y en la posterior inducción de la exocitosis acrosomal.

En nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en el que los anticuerpos del fluido folicular fueron utilizados para identificar proteínas de espermatozoides capacitados, involucradas en una respuesta funcional. Si se considera que los anticuerpos presentes en el suero pueden ser diferentes de los contenidos en las secreciones del tracto femenino²⁶ la identificación de estas proteínas aportaría información adicional a la existente a partir de estudios que utilizan suero u otra fuente de anticuerpos. Su secuenciación permitirá determinar su identidad y estudios adicionales contribuirán a confirmar su importancia funcional.

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