SEGUIMIENTO DE GENES DE VIRULENCIA DE <I>HELICOBACTER PYLORI </I>EN PACIENTES CHILENOS

Artículo completo
Introducción
La infección por Helicobacter pylori se establece en la región antropilórica del estómago en la mayoría de los individuos infectados, generando una inflamación crónica, asintomática y de larga duración, posiblemente debido a que los mecanismos defensivos inmunológicos del huésped fallan en su eliminación.^1,2 La persistencia de la infección en ciertos pacientes resulta en enfermedades graves, que progresan de gastritis crónica a úlcera péptica, gastritis atrófica, linfoma MALT y adenocarcinoma gástrico.^3-⁵ A pesar de la alta prevalencia de la infección por H. pylori, sólo una minoría de individuos infectados evoluciona hacia una enfermedad maligna. Esto puede deberse a la diversidad genética entre individuos,⁶ a factores ambientales como el tipo de dieta, la edad de la primera infección⁷ y factores de virulencia específicos de la bacteria.^8,9 El gen cagA, que codifica un antígeno inmunodominante, no se presenta en todas las cepas de H. pylori¹⁰ peroforma parte del islote de patogenicidad (cagPAI), que contiene 31 genes.¹¹ Por lo tanto, su detección molecular indica la presencia del PAI en el cromosoma del microorganismo.⁹ Las cepas cag+ (cepas tipo I) se asocian a mayor virulencia al inducir daño gástrico visible, mientras que las cepas cag- (cepas tipo II) se asocian con menor virulencia y se comportan como bacterias comensales más que patógenas.¹¹ Otro gen de interés, vacA, codifica para la citotoxina vacuolizante, que se secreta en alrededor del 50% de las cepas de H. pylori y causa degeneración vacuolar de las células gástricas epiteliales y ulceración de la mucosa gástrica.¹² El gen vacA presenta mosaico genético sobre la base de variaciones alélicas en las regiones media (alelos m1 o m2 y subtipos) y de señal (alelos s1 o s2 y subtipos) del gen.^13,14 Específicamente, se ha demostrado que cepas vacA s1/m1 poseen una elevada actividad citotóxica en comparación con cepas s1/m2, y que las cepas s2/m2 no tendrían actividad citotóxica.¹³
También se ha demostrado que ciertos factores de adherencia bacteriana contribuyen a la patogenicidad de H. pylori.^15-17 Así, la adhesina codificada por el gen babA2 favorece una unión persistente entre el microorganismo y la célula epitelial gástrica, por unión de la célula bacteriana a través de su proteína BabA2 con antígeno de grupo Lewis B (Le^B) presente en la mucosa gástrica.¹⁸ Por lo tanto, cepas de H. pylori babA2 positivas presentan mayor capacidad de adherencia, en cambio, las cepas babA2 negativas se adhieren débilmente.¹⁸ Esta adherencia se asocia con altos niveles de infiltración linfocitaria, atrofia glandular, metaplasia intestinal e incremento de la proliferación epitelial, y se comunicó una asociación significativa con úlcera duodenal y cáncer gástrico.¹⁹ De acuerdo con Yu y col.,¹⁷ el gen babA2 podría ser un marcador molecular útil para identificar pacientes con mayor riesgo de enfermedad grave asociada a infecciones por H. pylori. En este sentido, Alves Oliveira y col.,²⁰ en un estudio en Brasil, informaron una fuerte asociación entre babA2 y la presencia de úlcera péptica o carcinoma gástrico.
Trabajos en relación con el gen iceA señalan que sus alelos son factores de virulencia específicos de determinadas enfermedades; así, algunos autores relacionan a iceA2 con gastritis crónica y a iceA1 con úlcera duodenal.²¹
Lu y col. describieron, en 2005, un nuevo gen asociado a virulencia, el gen dupA (duodenal ulcer promoting),²² el cual estaría asociado con una intensa infiltración de neutrófilos y con altos niveles de producción de IL-8 en el antro, es decir, un gen promotor de úlcera duodenal y, lo más destacable, su presencia actuaría como un marcador de protección contra atrofia gástrica, metaplasia intestinal y cáncer gástrico. No se conoce su función, pero es homólogo a VirB4, que funciona como ATPasa en un sistema de secreción tipo IV. Arachchi y col., en 2007, en un estudio poblacional de la India,²³ apoyan la asociación de dupA con la úlcera duodenal, señalan además una asociación entre dupA y cagA.
Sin embargo, estudios recientes también discrepan en cuanto a la verdadera asociación que tendría dupA con las diferentes enfermedades gástricas. Argent y col.²⁴ analizaron pacientes de Bélgica, Sudáfrica, China y Norteamérica, y demostraron que dupA no tiene asociación con ulcera duodenal. Contrariamente a lo que sugieren Lu y col., ellos encuentran que este gen estaría asociado con cáncer gástrico. Un estudio reciente en población iraní (Douraghi y col., 2008)²⁵ indica que la presencia de dupA no está asociada a ningún trastorno gástrico en particular.
En 2007 Rhead y col. describieron un nuevo determinante de la toxicidad de la proteína VacA, al cual denominaron región intermedia vacAi, que presenta dos variantes polimórficas (i1 e i2).²⁶ Según estos autores, vacAi tiene actividad vacuolizante propia y estaría asociado con adenocarcinoma gástrico de manera independiente y más fuerte que la asociación del tipo vacAs o vacAm, o del estado cagA es decir, es un mejor predictor de cepas de H. pylori con potencial carcinogénico que las ya mencionadas región señal y media del gen vacA.
En su estudio con 32 pacientes con cáncer gástrico y 43 con úlcera duodenal, ambas patologías presentaron el genotipo s1/m1 y principalmente asociado a la variante polimórfica tipo i1. Las cepas s2/m2 se asociaron todas con la variante tipo i2. Al comparar los porcentajes para cáncer gástrico y úlcera duodenal, determinaron que el genotipo i1 se asocia significativamente con cáncer gástrico, ya que el 80% de los pacientes presentaba el genotipo vacAi1, mientras que sólo el 37% con úlcera duodenal se asoció a este genotipo.
Es importante considerar que la frecuencia de determinantes de virulencia y su asociación con enfermedades gastrointestinales varía considerablemente en diferentes regiones geográficas y que, en general, sería el conjunto de genes de virulencia que puede presentar una cepa de H. pylori, más que la presencia de un solo gen, lo que se asociaría con mayor gravedad de la lesión gástrica. Así, se ha informado que cepas cagA, vacAs1m1 estarían asociadas a la manifestación de úlcera y cepas triple positivas cagA, vacAs1, babA2 a úlcera, metaplasia y adenocarcinoma gástrico.^19,27
En Chile, más del 90% de los pacientes con úlcera péptica y el 42% de quienes consultan por dispepsia no ulcerosa están infectados por H. pylori.²⁸A pesar de la elevada prevalencia de infección por H. pylori en nuestro país, aún son pocos los trabajos en genotipificación de cepas que incluyen los genes cagA, vacA e iceA,^29-31 y no se encuentran trabajos con respecto a los genes dupA y vacAi.
Por ello, el objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de H. pylori detectado en biopsias gástricas de pacientes chilenos adultos y pediátricos, y comparar su distribución a lo largo del tiempo (período 1998-2007), sobre la base de los genes cagA, vacA (s, m, i), babA2, iceA (1, 2) y dupA; y por último, determinar si existe mezcla de cepas de H. pylori en estas biopsias mediante la determinación de los alelos de vacA (s1a, s1b y s2) y de iceA (1 y 2).

Material y método
Biopsias
Se procesaron las biopsias gástricas provenientes de 1 577 pacientes (1 394 adultos y 183 niños) sometidos a endoscopia digestiva alta (EDA) por indicación médica y que acudieron a centros hospitalarios o clínicas particulares de diversas ciudades de Chile, entre enero de 2003 y diciembre de 2007. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para utilizar parte de la biopsia de la zona antral, del cuerpo o de ambas regiones, para cultivo y genotipificación. Se siguieron las recomendaciones del European Helicobacter pylori Study Group (1997).³²
Fueron excluidas todos aquellas biopsias de personas con tratamiento de erradicación de H. pylori, uso de antagonistas H2, de inhibidores de la bomba de protones o de ambos, en las cuatro semanas precedentes a la endoscopia.

Cepas bacterianas, cultivo de H. pylori e identificación
Como controles se emplearon las siguientes cepas: H. pylori ATCC 43504 (cagA, iceA2, vacAs1, vacAam1, babA2); H. pylori 72A (vacAs1b, vacAm2, dupA), H. pylori 86C (iceA1), H. pylori 119A (vacAi1) y H. pylori 131C (vacAi2), aisladas en nuestro laboratorio.
Todos los cultivos se realizaron en agar Columbia suplementado con 5% de sangre de caballo e inhibidor de la microbiota acompañante (DENT), a 37ºC, en microaerofilia (10% de CO₂), por cuatro días. Las colonias se identificaron mediante prueba de ureasa, catalasa y tinción de Gram y las cepas identificadas positivamente como H. pylori se almacenaron en caldo Tripticasa con 15% de glicerol a -70ºC. Para el aislamiento de cepas clínicas, las biopsias gástricas se maceraron y homogenizaron en suero fisiológico y fueron cultivadas en iguales condiciones que las cepas control.

Extracción de ADN
Cada una de las biopsias (antro y cuerpo), mantenidas en suero fisiológico a 4ºC, fueron procesadas utilizando el kit comercial Tissue DNA Etzna (GenLab). El ADN extraído se suspendió en agua destilada estéril libre de nucleasas y se procesó de inmediato o fue almacenado a -20°C hasta su uso. Para evaluar el rendimiento en la extracción de ADN se ocupó la presencia de productos de PCR del gen de beta-actina humana.
Para realizar la extracción de ADN a partir de cultivo, se preparó una suspensión celular desde un tapiz bacteriano de H. pylori (aproximadamente 10⁸ UFC/ml) en suero fisiológico estéril y se extrajo el ADN de acuerdo con el método descrito por Mazurier y col.³³ El ADN extraído se suspendió en agua destilada estéril libre de nucleasas y se procesó de inmediato o se almacenó a -20°C hasta su uso.

Detección de los genes cagA, vacA, babA2, iceA y dupA por PCR convencional simple
Mediante PCR se detectó H. pylori en 768 pacientes adultos (ya sea en antro, en cuerpo o en ambos sitios). En 374 de ellos, escogidos al azar, las cepas de H. pylori se genotipificaron utilizando partidores para cagA, vacA (s1a, s1b, s2, m1, m2, i1 e i2), babA2, iceA (1 y 2) y dupA descritos en la literatura (Tabla 1).

Las secuencias de los partidores utilizados, el tamaño de los productos esperados y las referencias para las condiciones de amplificación respectivas se describen en la Tabla 1. Cada mezcla de reacción contenía 0.7 U de Taq polimerasa (Invitrogen); MgCl₂ 2.5 mM, dNTPs 0.2 mM; 0.5 μM de cada iniciador en buffer de PCR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH: 9.0), 0.1% Triton X-100) y 10 μl de ADN en un volumen final de 25 μl. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.7% (p/v) seguido de tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/ml) y visualización mediante transiluminador UV.

Determinación de la existencia de mezclas de cepas de H. pylori mediante la amplificación por PCR simple de los genes vacA e iceA
Se determinó si existía mezcla de cepas de H. pylori en 628 muestras de biopsias gástricas de adultos (correspondientes a antro y cuerpo de 314 pacientes).
El criterio para decidir si había mezcla de cepas de H. pylori fue el siguiente: la detección de más de un alelo, ya fuera de vacAs y/o vacAm y/o de iceA en una muestra de biopsia, ya fuera del antro, del cuerpo o de ambos sitios en un mismo individuo.

Comparación de la prevalencia de los genes de virulencia de H. pylori en población adulta y pediátrica
Para realizar esta comparación se utilizó el dato de prevalencia de los diversos genes de H. pylori obtenido en 374 pacientes adultos (antes mencionando) con el porcentaje de niños positivos para H. pylori del total de la población pediátrica, que equivale a biopsias de antro o de cuerpo de 183 niños.
Correlación en la detección de un gen especie específico para H. pylori y de diversos genes asociados a virulencia tanto en biopsias gástricas como a partir de los cultivos de sus biopsias.
Se determinó la correlación en la detección del gen especie específico para H. pylori (hpy) y de los diversos genes asociados a virulencia (cagA, vacA, babA2, iceA y dupA) en 72 biopsias gástricas y sus respectivos aislados clínicos subcultivados a partir del cultivo primario de estas biopsias.

Comparación de las prevalencias de genes asociados a virulencia en un seguimiento de 10 años
Se compararon los resultados de las prevalencia de algunos genes asociados a virulencia entre 1998 y 2007. Las comparaciones se hicieron empleando los datos obtenidos en distintos períodos, a partir de los cultivos o de biopsia. En los períodos 1998-2000 y 2001-2002, se emplearon sólo cultivos y no se realizó detección de los genes iceA, dupA y vacAi.²⁹ En el período 2003-2007, se utilizó ADN extraído desde biopsias gástricas (datos sin publicar).

Resultados
La pesquisa de genes de virulencia de H. pylori, ya sea directamente desde biopsias gástricas de pacientes con indicación de endoscopia digestiva alta o a partir del cultivo obtenido de esta biopsia, constituye una herramienta importante para detectar y caracterizar cepas específicas que presentan mayor potencial patogénico.
El análisis de 1 577 biopsias gástricas, provenientes de igual número de pacientes chilenos, de los cuales 183 eran niños, permitió la detección de H. pylori en 768 de los adultos, lo que equivale a una prevalencia de la bacteria en la población adulta sintomática de 48.7%.
En 374 de los adultos, seleccionados al azar, en que se detectó la bacteria, ya sea en antro o cuerpo, se realizó detección de los genes cagA, vacA (s1a, s1b, s2, m1, m2), babA2, iceA (1 y 2) y dupA, utilizando para ello partidores descritos en la literatura (Tabla 1). En la Figura 1 se muestran los productos de la amplificación mediante PCR convencional para los genes de virulencia cagA, vacAm1, babA2, iceA2 y dupA de H. pylori detectados en biopsias gástricas, y sus respectivos controles positivos, negativos y marcadores de peso molecular. Los porcentajes de detección para los diversos genes analizados fueron los siguientes: cagA en 29.4%, vacAm1 en 52.7%, vacAm2 en 61.8%, vacAs1a en 46.5%, vacAs1b en 28.3%, vacAs2 en 41.7%, vacAi1 en 30.9%, vacAi2 en 12.0%, babA2 en 3.5%, iceA1 en 30.5%, iceA2 en 61.2% y dupA en 28.9%.

Por otra parte, la prevalencia de H. pylori en la población pediátrica fue de 23%, considerando paciente H. pylori positivo con el mismo criterio que para la población adulta. Cabe destacar que sólo se pudieron detectar los diversos genes de virulencia en 31 muestras de biopsias de niños (datos no mostrados). Esto se debió a la dificultad de la toma de biopsia gástrica en los niños, lo que incidió en su calidad, ya que no permitió realizar una extracción de ADN eficiente para detectar los genes de virulencia en el total de las muestras pediátricas positivas por PCR para H. pylori. Pese a ello, se pudo observar que sólo el gen cagA presentaba una prevalencia similar en las poblaciones adulta y pediátrica (29.4% y 27.7%, respectivamente), ya que para los otros genes estudiados los porcentajes de detección variaron al menos en un 7%.
En cuanto a la detección de mezclas de cepas de H. pylori presentes en un mismo paciente (considerando sus muestras de antro y de cuerpo), se observó que un 23.7% de los adultos tenía más de un cepa bacteriana en su biopsia, ya que presentaban mezclas alélicas de genes s1a, sb, s2 y/o m1, m2 y/o iceA1 y 2. Al realizar este análisis en la población infantil se obtuvo un 36% de mezcla con un número pequeño de pacientes (n = 31).
Los resultados de detección de los diversos genes tanto en biopsias como a partir de sus cultivos, muestran una buena correlación. Se observó más de un 90% de concordancia cuando se analizaron los genes hpy, cagA, babA2, iceA1 e iceA2; la concordancia osciló entre 80% y 90% para los genes vacAm1, vacAm2, vacAs1b y vacAs2, y fue de un 70% para dupA. La menor concordancia, por debajo de 70%, se detectó para vacAs1a (Tabla 2).

Por último, en la Figura 2 se puede observar la comparación de las prevalencias para los diversos genes de virulencia de H. pylori en el período 1998-2007. Si bien no son totalmente comparables los datos con los períodos anteriores por diversas causas, como el número diferente, la detección a partir de biopsias o cultivos, en términos generales se puede decir que los genes cagA, vacAs1a, vacAs1b, vacAs2 y vacAm2 han mantenido su prevalencia en una década. Por otra parte, los genes vacAm1 y babA2 han aumentado su prevalencia, pero cabe destacar que babA2 continúa mostrando una muy baja prevalencia.

Discusión
Nuestro grupo de investigación se ha dedicado durante 12 años a caracterizar H. pylori en la población chilena, tanto en su resistencia a diversos agentes antibacterianos como sobre la base de sus genes de virulencia.^29,36 Respecto de esto último, conocer los perfiles genéticos asociados a virulencia de cepas de H. pylori entrega información fisiopatológica útil, que puede tener consecuencias clínicas significativas.³⁷
Estudios de poblaciones de Oriente y Occidente señalan que tanto la prevalencia de H. pylori como la de sus genes de virulencia varían de acuerdo con la localidad geográfica y a la edad del individuo.^16,38-40 Araya y col. informaron en 2004 una prevalencia detectada por PCR del 82.3% en pacientes provenientes de Temuco,³¹ una ciudad al sur de Concepción, mientras que para Colombia, Ecuador y Venezuela fue de 90%, 71.4% y 75%, respectivamente.^41-43 Nuestros resultados muestran una menor prevalencia de infección de H. pylori que lo informado hasta el momento en población chilena y latinoamericana.
Respecto de la diferencia en la prevalencia de genes de virulencia según la localización geográfica, estudios en Japón muestran una prevalencia de babA2 cercana al 85%,¹⁵ en tanto que resultados obtenidos en población coreana presentaron 36.1% de cepas babA2 positivas.¹⁶ A diferencia de estos estudios, en los diversos trabajos realizados por nuestro grupo, tanto a partir del ADN extraído de cultivos de H. pylori como de biopsias gástricas, el porcentaje de detección de este gen es bastante bajo, oscila entre 1.5% y 3.5%.
En el presente estudio (2003-2007) y en forma similar a lo observado en los dos anteriores en que se analizaron cepas aisladas en 1998-2000 y 2001-2002,^29,36 se mantuvo relativamente estable la prevalencia del gen cagA y sigue siendo inferior al 40%. Este es un resultado interesante para comentar por la importancia de cagA como marcador de virulencia. Al comparar la detección de los genes de virulencia a partir de las biopsias gástricas en población adulta y pediátrica sólo para este gen, no hubo diferencias apreciables (27.7% adultos y 29.4% niños). Además, el porcentaje de concordancia en cuanto a su detección directamente desde la biopsia como a partir de cultivo es una de las más altas (91.2%). Cabe destacar que, en general, la concordancia para los diversos genes fue bastante alta, lo que sugiere que los estudios de vigilancia epidemiológica de los genes de virulencia de H. pylori se pueden realizar tanto directamente desde las biopsias gástricas como desde los cultivos generados por ellas.
Al analizar la secuencia señal de vacA se observa un predominio del genotipo vacAs1a respecto de vacAs1b y de vacAs2. En cuanto a la región media del gen vacA, se observa que sigue siendo más frecuente el genotipo vacAm2, tanto en los aislamientos clínicos de H. pylori como en las muestras de biopsias. Para el gen vacAm1 se detectó un aumento progresivo de su prevalencia en el tiempo.
Respecto del gen iceA, sólo investigado en nuestro último estudio, se observó un claro predomino del alelo iceA2, el cual algunos autores relacionan con gastritis crónica, a diferencia del alelo iceA1 que es relacionado con úlcera duodenal.²¹ Resultados obtenidos en la población de la IX Región de Chile³¹ señalan que no se observó relación entre los alelos iceA y los hallazgos patológicos de la gastritis.
En nuestro último estudio, el gen detectado con mayor prevalencia junto a vacAm2 fue iceA2 (Figura 2). Este resultado es similar a lo informado en Brasil, donde se encontró una prevalencia para iceA2 del 90%.⁴⁴ En Colombia,⁴¹ aunque el porcentaje fue menor (46.9%) el alelo iceA2 presentó mayor frecuencia que iceA1, similar a nuestros hallazgos, y contrasta con lo comunicado inicialmente en Asia, donde el alelo predominante es iceA1.^45,46 En nuestro trabajo, el porcentaje de pacientes que presentaron el gen iceA1 fue similar a los países de la región, lo que muestra claramente que en Latinoamérica el alelo predominante es iceA2.
La detección del gen dupA, tanto en aislamientos clínicos de H. pylori como a partir de biopsias gástricas constituye el primer informe de la prevalencia de este gen en población chilena; al igual que para las variantes alélicas vacAi1 y vacAi2. Por tanto, será interesante hacer el seguimiento de estos nuevos marcadores de virulencia.
Estudios de genotipificación de cepas de H. pylori de pacientes chilenos mostraron que la presencia del gen cagA o de la variante alélica vacAs1 por sí solas no tendría un valor predictivo de riesgo de enfermedades gástricas graves. Sin embargo, cuando la cepa presenta el genotipo cagA/vacA s1m1, habría un mayor riesgo de enfermedad ulcerosa péptica.^29,38
Por otra parte, trabajos en población de la Región de la Araucanía (IX Región), Chile,³¹ concluyen que la presencia del gen cagA o de los alelos s1/m1 del gen vacA se correlaciona directamente con la infiltración por neutrófilos y con la gravedad del daño epitelial, mientras que el genotipo vacAs2/m2 se asocia en forma significativa con daño ligero de la mucosa o ausencia de daño.
Finalmente, datos no mostrados en este trabajo, dado que constituyen parte de una patente recientemente solicitada, relacionada con el desarrollo de un kit de detección molecular de cepas más virulentas de H. pylori, indican que los genes cagA, vacAm1 y dupA constituyen los genes asociados a mayor riesgo de enfermedades graves en la infección por este microorganismo en población chilena.
De los resultados en su conjunto podemos mencionar las siguientes conclusiones: 1) un porcentaje considerable de biopsias gástricas presenta mezcla de cepas de H. pylori, lo que indica que existe presencia de infección múltiple en los pacientes; 2) una muy buena concordancia en la detección de los diversos genes de virulencia, ya sea directamente desde la biopsia o de los aislamientos clínicos, indica que puede usarse indistintamente la biopsia o su cultivo en la genotipificación de cepas de H. pylori de población chilena sintomática; 3) el gen cagA ha mantenido su prevalencia en el tiempo, no presenta una diferencia apreciable en su prevalencia en población adulta y pediátrica y tiene una muy buena concordancia en biopsia y cultivo, lo que es de interés dada su importancia como marcador de virulencia, y 4) en forma similar a cagA, la mayoría de los otros genes estudiados han mantenido su prevalencia en el tiempo, excepto vacAm1 y babA2 que la han aumentado. Este último, a pesar de incrementarse, sigue teniendo una prevalencia muy baja.
Las proyecciones de nuestra investigación en este tema indican que se requiere seguir manteniendo una vigilancia epidemiológica de la bacteria en pacientes sintomáticos sobre la base de sus genes de virulencia, ya que sin duda existe una importante asociación de la infección por H. pylori con cáncer gástrico, úlcera péptica y otras enfermedades gastroduodenales. Además, aunque sólo algunos individuos presentan alguna sintomatología, la pesquisa de genes de virulencia en muestras gástricas constituye una herramienta importante para caracterizar y detectar cepas específicas que presentan mayor potencial patogénico.^47,48

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