I. Perspectivas en hemostasia y cáncer
Las complicaciones tromboembólicas a menudo se asocian con elevada morbilidad y mortalidad en pacientes con cáncer.^1,2 Si bien las complicaciones sistémicas de la activación de la hemostasia influyen desfavorablemente en la evolución clínica de los enfermos con cáncer, existen indicios de que la activación intratumoral de la coagulación se asocia con propiedades que promueven el crecimiento del tumor, incluso invasión y metástasis.^3,4
El aumento de la permeabilidad vascular en neoplasias facilita la extravasación de los factores circulantes de la coagulación y de otras proteínas como fibrinógeno.⁵
En condiciones normales, el fibrinógeno se encuentra en pequeñas cantidades en la matriz extracelular. En sujetos con cáncer se detectan niveles elevados de fibrinógeno en la circulación. Los vasos tumorales tienen mayor cinética de extravasación de fibrinógeno debido al aumento de la permeabilidad vascular tumoral que se encuentra en pacientes con cáncer. El fibrinógeno extravasado se convierte rápidamente en fibrina en el microambiente procoagulante del estroma tumoral. La matriz de fibrina se considera de especial importancia en la angiogénesis y, por lo tanto, en el crecimiento tumoral.⁶
La interacción entre los componentes de la hemostasia, fibrinólisis y crecimiento tumoral está ejemplificada en la vía del plasminógeno-plasmina. La activación de la uroquinasa-plasminógeno y del plasminógeno tisular está involucrada en los procesos celulares que se asocian con desarrollo embrionario, cicatrización de heridas y crecimiento tumoral. La falta de crecimiento de tumores en ratones deficientes en PAI-1 muestra la necesidad de un delicado equilibrio entre la proteólisis de la matriz extracelular y la inhibición de la proteólisis para el crecimiento de tumores.⁷ Las pacientes con cáncer de mama expresan niveles altos de estas serinproteasas. Los niveles elevados intratumorales de componentes del sistema de la uroquinasa confieren un pronóstico más desfavorable en individuos con cáncer.⁸ La concentración intratumoral de uroquinasa-activador de plasminógeno se eleva y predice un pronóstico desfavorable en enfermos con cáncer de colon.⁹ Estas observaciones sugieren que los productos de degradación de fibrina (y fibrinógeno, PDF) más allá de reflejar la fibrinolisis intratumoral, son importantes al inducir el crecimiento tumoral. Ellos modulan el sistema inmunológico y están involucrados en la regulación del sistema plasmina-plasminógeno.^10,11 Se han descrito propiedades angiogénicas de los productos PDF que también aumentan la síntesis de IL-6 en monocitos.^12,13 La fibrinólisis es parte activa del remodelamiento del estroma.¹⁴ La fibrina es degradada por la plasmina derivada de tumores en varios fragmentos, entre los cuales los D-dímeros presentan mayor interés y complejidad.
En pacientes con cáncer de pulmón, los niveles altos de productos de la fibrinólisis, D-dímeros, anticipan menor supervivencia.¹⁵ En pacientes con cáncer de mama, la concentración elevada de D-dímeros predice compromiso ganglionar e invasión linfovascular y se correlaciona con el estadio clínico.¹⁶ En sujetos con cáncer colorrectal, los niveles aumentados de D-dímeros se asocian con el tamaño del tumor, con metástasis ganglionares y hepáticas, con invasión linfática y con diseminación peritoneal. La correlación entre los D-dímeros y el estadio del cáncer de colon sugiere una relación con la carga tumoral.¹⁷ El ambiente procoagulante antes mencionado no sólo se restringe al dominio extravascular de los tumores. Las células endoteliales también muestran un fenotipo procoagulante caracterizado, por ejemplo, por mayor expresión de factor tisular que puede incrementar la adherencia y la agregación de plaquetas.¹⁸ Se ha visto que las plaquetas se adhieren y agregan en el ambiente procoagulante tumoral. Es llamativo que en ratones trombocitopénicos se observan tumores de menor tamaño. Esta observación sugiere una contribución de las plaquetas al crecimiento tumoral.
Sin embargo, aún no se tiene una prueba definitiva de que las plaquetas tengan un papel sustancial como promotoras del crecimiento tumoral. Existen pruebas en relación con la contribución de las plaquetas en la aparición de metástasis. Las células tumorales pueden promover agregación de plaquetas. Esta capacidad agregante de plaquetas de las células de tumor se correlaciona con su potencial metastásico. La adherencia de plaquetas a células tumorales circulantes las protege de la actividad lítica de las células asesinas naturales; la trombocitosis se asocia con pronóstico más desfavorable en pacientes con cáncer colorrectal y de pulmón. Estas observaciones sugieren que las plaquetas no son un simple espectador en la carcinogénesis.^19,20
Otros investigadores y nosotros hemos acumulado pruebas acerca del papel de las plaquetas como principales transportadores del VEGF. Las plaquetas de los pacientes con cáncer tienen, en comparación con las de controles sanos, un contenido más alto de VEGF.²¹ El significado biológico de esta mayor carga de VEGF en sujetos con tumores no está claro aún. Pinedo y col. postularon un papel de las plaquetas en la inducción de angiogénesis a través de la liberación local de moléculas proangiogénicas (VEGF, bFGF, PDGF). Aunque las plaquetas tienen proteínas antiangiogénicas (TSP-1, PF-4) se ha demostrado un efecto neto a favor de la angiogénesis.^22,23

II. Aspectos más importantes y perspectivas futuras de "Los niveles plasmáticos de D-dímeros se correlacionan con el volumen del tumor, el índice de progresión y la sobrevida en enfermos con cáncer de mama metastásico" (Dirix y colaboradores, Br. J. Cancer, 2002)
En este estudio hemos investigado la relación entre los marcadores del metabolismo de la fibrina (D-dímeros), las variables clínicas y patológicas estándar y los niveles séricos de citoquinas angiogénicas (IL-6 y VEGF) en tres poblaciones: el grupo A (n: 30) estuvo integrado por 30 voluntarias sanas; el grupo B (n: 23) abarcó pacientes consecutivas con cáncer de mama operable, y el grupo C (n: 84) incluyó enfermas con cáncer de mama no tratado o progresivo metastásico. Los D- dímeros plasmáticos, fibrinógeno, IL-6, VEGF y el contenido calculado de VEGF en plaquetas están claramente elevados en pacientes con cáncer de mama. Los D- dímeros estuvieron incrementados en casi un 89% de las pacientes con enfermedad metastásica progresiva. El nivel de D-dímeros se correlacionó en forma positiva con la carga tumoral (p < 0.0001), con el número de sitios metastásicos (p = 0.002), con la cinética de progresión (p < 0.0001) y con las citoquinas relacionadas con la angiogénesis: VEGF sérico (p = 0.0016, correlación Spearman = 0.285); carga de VEGF calculada en plaquetas (p < 0.0001; correlación Spearman = 0.37) y nivel sérico de IL-6 (p < 0.0001, correlación Spearman = 0.59). De manera similar, los niveles de D-dímeros se correlacionaron positivamente con mayor concentración de fibrinógeno (p < 0.0001, correlación Spearman = 0.38). La asociación entre marcadores de la degradación de fibrina en pacientes con cáncer de mama progresivo sugiere que el nivel de D-dímeros es un indicador clínicamente importante de progresión y apunta hacia una relación entre la hemostasia y la evolución del tumor. Estas observaciones sugieren la participación de la IL-6 por su influencia sobre la angiogénesis y la hemostasia.²⁴
En un estudio posterior²⁵ medimos los factores angiogénicos circulantes (VEGF-A, IL-6 y el fragmento D-dímero de la fibrina) en vena mesentérica, vena uterina y en muestras periféricas arteriales y venosas en 21 pacientes aleatoriamente seleccionados con cáncer colorrectal operable y carcinoma cervical u ovárico para dilucidar el origen de estos factores angiogénicos que generalmente se encuentran elevados en enfermos con neoplasias. Además, se efectuó inmunohistoquímica para VEGF-A e IL-6 en tumores colorrectales de estos individuos. El VEGF-A de suero y plasma no estuvo significativamente elevado en las venas que drenan tumores a pesar de la expresión celular tumoral de VEGF-A. Por ende, el VEGF sérico no deriva en su totalidad de las células tumorales. Por el contrario, la IL-6 sérica estuvo considerablemente aumentada en las venas de drenaje tumoral en concordancia con la expresión de IL-6 en el citoplasma de las células tumorales. Se constató que en la línea celular megacarioblástica MEG-01 la expresión de VEGF-A estuvo regulada por la IL-6. Es por ello que el mayor contenido de VEGF-A en plaquetas –que se asocia con mayor nivel sérico de VEGF en pacientes con cáncer– puede obedecer en parte a la estimulación de la expresión de VEGF-A mediada por IL-6 en el precursor plaquetario megacariocito. Luego realizamos un análisis inmunohistoquímico de plaquetas y fibrina en tumores con la finalidad de brindar más pruebas de la hemostasia intratumoral. Mediante inmunohistoquímica confirmamos que las plaquetas se adhieren y agregan en el endotelio del tumor. Proponemos que la IL-6 promueve indirectamente la angiogénesis tumoral a través de la estimulación de la carga de VEGF-A en plaquetas. Además, las correlaciones encontradas entre la IL-6, fibrinógeno y niveles de D-dímeros en sangre venosa periférica y la concentración alta de D- dímeros en las venas que drenan el tumor, en concordancia con depósitos de fibrina encontrados en el estroma tumoral, sugieren un papel importante de la IL-6 en el metabolismo extravascular del fibrinógeno. Nuestros resultados sugieren la participación crucial de la IL-6 en la conexión intrínseca entre hemostasia y angiogénesis.

III. Angiogénesis y hemostasia en cáncer: las dos caras de una misma moneda
Tal como se mencionó, los componentes de la hemostasia (por ejemplo, factor tisular, trombomodulina, trombina) tienen importante participación más allá de la simple regulación de la hemostasia. Estos factores están involucrados en situaciones fisiológicas –cicatrización de heridas y ciclo menstrual–así como en condiciones fisiopatológicas como arteriosclerosis y cáncer. La regulación de la integridad tisular se considera que no sólo depende del aporte adecuado de factores nutricionales por los vasos sanguíneos recientemente formados sino también de la correspondiente remoción de productos de desecho. Las interacciones autocrinas y paracrinas entre los factores de crecimiento producidos por los vasos sanguíneos y otras células –fibroblastos– se suman a la funcionalidad de estos procesos.^26,27
Existe una llamativa redundancia funcional para los factores de crecimiento asociados con angiogénesis más allá de la simple inducción de proliferación, migración y diferenciación endotelial. El VEGF-A secretado por las células tumorales no sólo ha sido involucrado en la regulación inmunológica intratumoral sino también en la inducción de un activador principal del sistema extrínseco de la coagulación: el factor tisular. Este efecto está mediado por la unión del factor de transcripción EGR-1 al sitio promotor del factor tisular inducida por VEGF. Los niveles altos de factor tisular son, independientemente de sus propiedades coagulantes, mitogénicos para las células endoteliales. La menor expresión del factor tisular en células tumorales se asocia con menor expresión de VEGF-A y con mayor expresión de trombospondina-1, que se asocia con inhibición de la angiogénesis.^28,29 Más aun, la producción de VEGF en fibroblastos luego de la unión del factor VIIa al factor tisular parece involucrar trombina y factor Xa.³⁰ Es interesante destacar que tanto el factor VIIa como la trombina son capaces de inducir la expresión de la proteína de la matriz extracelular Cyr61 y de factor de crecimiento del tejido conectivo.³¹
Estos ejemplos ilustran que la hemostasia y la angiogénesis son dos caras de una misma moneda, involucradas en forma simultánea en el remodelamiento tisular. Ambas están intrínsecamente conectadas e, in vivo, no pueden ocurrir en forma separada.
La activación de la hemostasia y de la angiogénesis está causada por la influencia recíproca de distintas células: tumorales, macrófagos mononucleares, plaquetas y células del estroma, como fibroblastos y células endoteliales, con la correspondiente activación en la superficie celular de factores de la coagulación. Proponemos un modelo celular de activación de la hemostasia y angiogénesis intratumoral en el contexto de la inducción del crecimiento tumoral (Figura 1). Las propiedades que promueven el crecimiento asociadas con la activación de la hemostasia intratumoral surgen por la interacción de la hemostasia y la angiogénesis involucradas en 1) efectos asociados con células tumorales como proliferación, invasión y supervivencia; 2) efectos sobre el remodelamiento del estroma como la formación de una matriz provisoria de fibrina asociada con la migración y supervivencia celular; 3) mayor formación de vasos nuevos y 4) participación del VEGF derivado de plaquetas en la inducción de angiogénesis.

Figura 1. Visión general de las interacciones hipotéticas entre hemostasia y angiogénesis en el crecimiento tumoral. Debe hacerse hincapié en que las células del estroma (fibroblastos, células de músculo liso, macrófagos) también contribuyen con la activación de la coagulación y la angiogénesis. Estas células no se ilustran por motivos de espacio. La interleuquina (IL) 6 producida por el tumor se asocia con elevación de los niveles circulantes de fibrinógeno al inducir su expresión y secreción en células hepáticas. Debido a que el VEGF-A aumenta la permeabilidad vascular en los vasos del tumor hay extravasación de proteínas circulantes (ejemplo, factores de la coagulación, vitronectina y fibrinógeno). El fibrinógeno-fibrina se metaboliza y se producen productos de degradación de la fibrina (fibrinógeno) que pueden influir en el crecimiento del tumor a través de un efecto directo o indirecto sobre las células endoteliales o tumorales. Hay adherencia, agregación y posiblemente extravasación de plaquetas y estas células liberan su contenido de VEGF-A sobre el endotelio y las células tumorales. El VEGF-A puede originarse por endocitosis de VEGF-A producido por las células tumorales o puede derivar de la mayor expresión del factor inducida por IL-6 en los precursores plaquetarios: megacariocitos. El VEGF-A proveniente de plaquetas y de células tumorales puede contribuir, por ejemplo, a aumentar la expresión del factor tisular, con la activación de la coagulación y celular (endotelial) por factores de coagulación (por ejemplo, factor X o trombina). El VEGF en la circulación que deriva del tumor o que es liberado por plaquetas puede ser depurado por estas mismas células o por receptores solubles para VEGF-A liberados por células endoteliales. La interacción recíproca entre la modulación mediada por la IL-6 en la hemostasia y angiogénesis en tumores primarios podría generar un ambiente propicio para la migración, proliferación y pasaje intravascular de células tumorales en áreas con densidad vascular relativamente alta.

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Introducción
Las investigaciones realizadas en los últimos 30 años establecieron que la angiogénesis es una etapa esencial en la progresión tumoral. Si bien en un principio se pensó que la angiogénesis era el resultado directo de la acción de un factor soluble sobre las células endoteliales, hoy se sabe que en la iniciación del proceso de neovascularización intervienen múltiples factores que actúan en diferentes niveles induciendo el crecimiento de los vasos sanguíneos.¹ El estímulo que provoca la iniciación del proceso angiogénico puede ser también indirecto, a través de las células del sistema inmune del huésped: macrófagos, linfocitos, mastocitos.
La Arg puede escindirse en citrulina y NO debido a la acción de una familia de isoenzimas: óxido nítrico sintasa neuronal (NOS1), endotelial (NOS3) e inducible (NOS2). El NO liberado está involucrado en la regulación de importantes funciones fisiológicas y patológicas y es un importante componente del microambiente tumoral ya que puede ser producido por las propias células tumorales, por las células endoteliales de la microvasculatura tumoral o por los macrófagos y células del estroma tumoral. Nosotros determinamos el papel que desempeña el NO sobre el crecimiento tumoral al actuar como parte de la cascada de señales que desencadenan el proceso angiogénico.² La Arg es el sustrato común de NOS y de arginasa (A) y esto significa que a partir de un mismo aminoácido, según cuál fuere la enzima que está disponible, se pueden obtener diferentes productos como la molécula reactiva NO (en el caso de las distintas isoformas NOS) o urea y ornitina (cuando actúan las isoformas AI y AII). La ornitina es un aminoácido precursor de poliaminas esenciales en el proceso de proliferación celular, o sea que, de alguna manera, los productos de estas enzimas están involucrados en la progresión tumoral. Las PG, que también regulan el desarrollo tumoral, son una serie de compuestos en cuya síntesis participan las isoformas COX-1 y COX-2. Su producción se vincula con la liberación de NO, lo que indica la existencia de interacciones entre las vías de señalización de ambas enzimas, COX y NOS. Nosotros demostramos que en las células tumorales LMM3, derivadas de un adenocarcinoma mamario murino, la PGE₂ modula positivamente la actividad de NOS, mientras que, por el contrario, el NO ejerce una retroalimentación negativa sobre la actividad COX.³
En numerosos estudios de biología tumoral, tanto experimentales como clínicos, se demostró que el NO, producido de manera endógena, promueve el crecimiento tumoral y la angiogénesis. Por otro lado, también se ha demostrado su participación en la inducción de apoptosis (muerte celular programada) tanto de células del sistema inmune como de células tumorales.⁴ Estos efectos opuestos del NO, contra el huésped o contra el tumor, dependen de dos variables de gran importancia: el nivel de producción de NO y la carga genética de las células tumorales.^5,6 Nosotros pudimos determinar que las células tumorales de diferentes líneas de adenocarcinomas murinos producen diferentes cantidades de NO y mostramos que existe una correlación inversa entre los niveles de NO y la citotoxicidad mediada por NO.⁷
Por otra parte, en la respuesta inmune antitumoral, es de crucial importancia la actividad regulatoria que ejercen los nódulos linfáticos regionales de un portador de tumor que puede conducir a un desequilibrio dependiente de la respuesta celular T.^8,9 Los macrófagos son importantes componentes del infiltrado leucocitario en los tumores, el papel que cumplen en la progresión tumoral es contradictorio, ya que pueden ser reguladores positivos al promover el crecimiento tumoral o reguladores negativos por su acción citotóxica contra el tumor y ambas acciones se ejercen a través de la via metabólica de la Arg.¹⁰
La participación aparentemente contradictoria del NO, las PG y las poliaminas en la relación huésped-tumor sugiere gran complejidad de su función sobre la biología tumoral y, por lo tanto, constituye un enorme desafío para profundizar su estudio.

Materiales y métodos
Animales
Se utilizaron ratones hembra de la cepa BALB/c, de 8 a 12 semanas de edad, criados en el bioterio de nuestro Instituto. El cuidado de los animales se realizó de acuerdo con los procedimientos indicados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH 1986).
Tumores
El tumor S13 es un adenocarcinoma mamario débilmente metastásico que apareció espontáneamente en ratones BALB/c y que se mantiene por trasplantes subcutáneos (s.c.). Los implantes del tumor S13 se realizan en el flanco izquierdo, con un trócar, para evaluar el crecimiento tumoral y las metástasis posquirúrgicas. Cuando se realizó la prueba de Winn se inoculó una suspensión enzimática de 1.5x10⁴ células tumorales en la almohadilla plantar de ratones normales.
La línea de células tumorales LMM3 se obtuvo previamente a partir de un adenocarcinoma mamario singeneico MM3. Los cultivos celulares se mantienen en monocapas a 37°C con 5% de CO₂ en medio de cultivo F15 suplementado con 5% suero fetal bovino y su viabilidad se determina con azul Trypan, se utilizan suspensiones con más del 90% de viabilidad.
Los ratones portadores de tumor se obtienen por inoculación subcutánea en flanco de 4x10⁵ células LMM3. Para la obtención de células peritoneales, los animales se sacrifican a los 7 días de portación del tumor.
Crecimiento tumoral
El crecimiento del tumor s.c. se expresa como diámetro promedio geométrico del tumor en mm, midiendo los dos diámetros perpendiculares de la masa tumoral que se determinan mediante un calibre Vernier 3 veces por semana.
Las metástasis pulmonares posquirúrgicas (operados el día 10) se observan al momento del sacrificio (25 días postrasplante) con una lupa. La incidencia metastásica se determina como porcentaje del número de animales que presentan metástasis con respecto al total de los animales operados.
Test de Winn
Este ensayo de neutralización in vivo consiste en inocular en la almohadilla plantar 1.5x10⁶ células del GLDT junto con 1.5x10⁴ células del tumor S13 en 0.05 ml de medio. El crecimiento del tumor se determina midiendo el grosor de la pata por medio de un calibre Mitutoyo, tres veces por semana, hasta el sacrificio de los animales.
Purificación de macrófagos
Las células de la cavidad peritoneal de animales normales y portadores de tumor LMM3 de 7 días se obtienen por lavado con medio de cultivo MEM suplementado con 10% de SFB. Los Mf normales (MfN) y Mf de portadores de tumor (MfT), se purifican por la técnica de adhesión al plástico durante 2 hs a 37°C. Luego de realizar 2 lavados con PBS, los Mf adheridos se recuperan por raspado y se resuspenden en medio de cultivo. La viabilidad de las células se determina por el ensayo de exclusión con azul Trypan, siendo siempre superior al 95%. Ensayo de angiogénesis
Ratones hembras normales de la cepa BALB/c se inoculan por vía i.d. en ambos flancos con: 2x10⁵ células LMM3 solas o cocultivadas con MfN o MfT (2x10³), 2x10⁵ células S13 o 4x10⁶ células de GLDT, en un volumen total de 0,1 ml de medio MEM con azul Trypan para localizar el sitio de inoculación. Luego de 5 días, los animales se sacrifican y la respuesta vascular se observa en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección WILD. El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm² de piel. Para ello se fotografían los sitios de inoculación, se proyectan sobre una cuadrícula y se cuenta el número de vasos. La densidad de vasos (δ) se determina por la fórmula:

	S número de vasos en cada cuadrado
d =
	número total de cuadrados

Determinación de la actividad de NOS
Los MfN y MfT (10⁵/200 μl de medio) se siembran en placas de plástico de 96 hoyos y se cultivan por 24 hs a 37°C. La concentración de nitrito en el sobrenadante libre de células se determina por la reacción colorimétrica de Griess. Brevemente, se mezclan iguales volúmenes de sobrenadante del cultivo con reactivo de Griess (1% de ácido sulfanílico en 30% de ácido acético en agua con 0.1% de cloruro de N-1-naftiletilendiamina en ácido acético al 60%. A los 15 minutos se lee la absorbancia a 590 nm con un lector de ELISA. La concentración de nitrito se determina con respecto a una curva estándar de nitrito de sodio diluido en medio. Los resultados se expresan en micromolar de NO^- ₂ por 10⁶ células (μM/10⁶ cél).
Determinación de la actividad arginasa
La actividad de arginasa se determina en lisados celulares según el método descrito por Modolell. Brevemente, 10⁵ MfN y MfT se lisan con 0.5 ml de buffer Triton X-100 al 0.1%. Después de 30 minutos se agregan 0.5 ml de Tris-HCl 25 mM conteniendo MnCl₂ 5 mM, pH 7.4. La enzima se activa por calentamiento a 56 °C durante 10 minutos. La hidrólisis de arginina se realiza incubando 25 μl del lisado activado con 25 μl de arginina 0.5 M, pH 9.7, a 37°C por 60 minutos. La reacción se detiene en medio ácido y la concentración de urea se determina a 540 nm, después de agregar 25 μl de α-isonitrosopropiofenona 9% (disuelta en etanol 100%). Los resultados se obtienen por extrapolación con una curva de urea, y se expresan en μmoles de urea/10⁶ cél.hora.
Determinación de la actividad de COX
Los Mf (2x10⁶) se incuban por 90 minutos a 37°C en 1 ml de medio con o sin el agregado de indometacina (INDO) 10^-6 M. Los sobrenadantes se congelan a -80°C hasta la determinación de PGE₂ por radioinmunoensayo (RIA) de acuerdo con el método de Granstrom. Brevemente, 100 μl de muestras o estándares se mezclan con 500 μl de antisuero anti-PGE₂ hecho en conejo. Posteriormente, se agrega 100 μl (5 pg) de [³H]-PGE₂ en cada tubo. Luego de la incubación se agrega una suspensión de carbón-dextrán para separar la fracción libre de la unida. La radiactividad presente en los sobrenadantes se determina con un contador de centelleo líquido utilizando solución centelleadora biodegradable. Los resultados se expresan en picogramos por 10⁶ células (pg/10⁶ cel.).
Detección de las isoformas de NOS por Western blot
Los Mf (10⁷) se lavan con PBS frío y luego se agrega 1 ml de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8, 100 mM NaCl conteniendo EGTA 2 mM, EDTA 2 mM , Triton X-100 1%, PMSF 10 mM, aprotinina 20 μg/ml, leupeptina 20 μg/ml, inhibidor de tripsina 100 μg/ml). El lisado celular se centrifuga a 10 000 g por 20 min. Los sobrenadantes se conservan a -80°C hasta su uso. La concentración proteica se determina por el método de Lowry. Las muestras se siembran en minigeles de SDS-poliacrilamida junto con estándares de peso molecular conocido. Finalizada la electroforesis, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se lavan con agua destilada. Las membranas de nitrocelulosa se bloquean con buffer Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, Tween 20 (0.05%) con 5% de leche descremada (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se incuban con anticuerpos policlonales anti-nNOS, anti- iNOS o anti-eNOS en TBST por 24 hs. Después de varios lavados con TBST, se incuban con el segundo anticuerpo (cabra anti-ratón o conejo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:4 000 en TBST) a 37°C durante 1 h. Las bandas se revelan con una mezcla de cloruro de nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4cloro-3- indolilfosfato-p-toluidina (NBT/BCIP). Las bandas se cuantifican por medio de un densitómetro computarizado conectado a un analizador de imágenes.
Detección de isoformas de arginasa por Western blot
Los MfN o MfT purificados se lavan 2 veces con PBS frío y se resuspenden con 300 μl de buffer de lisis: Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM, EDTA 0.1 mM, EGTA 0.1 mM, leupeptina 1 μg/ml, aprotinina 1 μg/ml y PMSF 0.1 mM. La lisis se completa por sonicado. Las muestras (25 μg por calle) son sometidas a electroforesis en geles de SDS-PAGE al 10%. Las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa por el método semilíquido. Después de varios lavados con agua destilada, se bloquean los sitios inespecíficos con buffer TBST con 5% de leche descremada, se incuba con el anticuerpo monoclonal anti-A I o con un anticuerpo de conejo anti-A II durante 18 hs a 4?C y luego 1 h con el segundo anticuerpo anti-IgG de ratón o de conejo conjugado con fosfatasa alcalina. Las bandas se visualizan con una mezcla NBT/BCIP. La cuantificación se realiza por densitometría en un analizador de imágenes computarizado.
Detección de CD31 (PECAM-1) por Western blot
Se obtienen muestras de piel del sitio angiogénico desprovistas de pelo y se las homogeneiza a 4?C en 4 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, EGTA 10 mM, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, leupeptina 10 μg/ml, aprotinina 10 μg/ml, inhibidor de tripsina 10 μg/ml, pH:7.4. Los homogenatos se centrifugaron a 4°C, 10 000 rpm por 10 minutos. Los sobrenadantes se guardan a –80ºC y la concentración de proteína se determinó por el método de Lowry. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10%, sembrándose aproximadamente 30 μg de proteína por calle. Luego, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa por el método semi- líquido. Después de varios lavados con agua destilada se las incuban con TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Se incuba durante 18 hs. con un anticuerpo policlonal anti-PECAM-1. Luego de 4 lavados con TBS-T se agrega el segundo anticuerpo anti-IgG conjugado con fosfatasa alcalina disuelto en TBS-T. Las bandas se visualizan con una mezcla NBT/BCIP. La cuantificación se realiza por densitometría en un analizador de imágenes computarizado.
Drogas
Todas las drogas fueron provistas por SIGMA-Aldrich, salvo otra especificación. Las soluciones se prepararon en el momento de cada ensayo. Se utilizó como inhibidor de NOS: N^ω nitro-L arginina metil ester (L-NAME) 10^-3 M y como inhibidor de COX: indometacina (INDO) 10^-6 M; para interferir la vía de la arginasa se utilizó L-valina (Val) 5x10^-2 M.
Estadística
Todos los experimentos se realizaron por lo menos 3 veces obteniéndose resultados comparables. La significación de los ensayos se determinó utilizando el test "t" de Student, el de ANOVA o el de Mann-Withney, utilizando el programa STAT Primer. Las diferencias entre las medias se consideraron significativas cuando p < 0.05. Los resultados son expresados como promedio ± E.S.

Resultados y discusión
Uno de los objetivos de este estudio fue identificar el papel que cumplen los GLDT S13 sobre el crecimiento tumoral. Confirmamos la participación del NO como promotor de la angiogénesis y de la progresión tumoral. Así observamos que animales tratados in vivo con un inhibidor no selectivo de NOS (L-NAME) presentan una disminución de la respuesta angiogénica, el crecimiento tumoral y la incidencia de metástasis (Figuras 1, 2 y 3). Se ha propuesto que la continua generación endógena de bajas concentraciones de NO por parte de las células tumorales contribuye al aumento de la respuesta angiogénica asociada al crecimiento tumoral.

Figura 1. Las células S13 (2x10⁵/0.1 ml) se inocularon en forma i.d. en ambos flancos de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (50 mg/kg día i.p.) durante los 5 días que dura el ensayo. De igual forma se inocularon 4x10⁶ células de ganglio drenante del tumor S13 (GLDT) provenientes de portadortes no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) durante el tiempo de portación del tumor. Los valores son promedios ± E.S. de 6 determinaciones, * p <0.0001.

Figura 2. El tumor S13 se implantó en forma s.c. por trócar en el flanco izquierdo de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) durante el tiempo de portación del tumor. Los diámetros tumorales (largo y ancho) se midieron tres veces por semana con un calibre Vernier y se graficó el diámetro geométrico promedio vs. días de progresión tumoral. Los valores son promedios ± E.S. de 10 determinaciones, * p < 0.001.

Figura 3. El tumor S13 se implantó en forma s.c. por trócar en el flanco izquierdo de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) durante el tiempo de portación del tumor. La cirugía del tumor primario se realizó a los 10 días de portación y las metástasis pulmonares se observaron al momento del sacrificio de los ratones. La incidencia de metástasis se expresa como porcentaje con respecto al número total de ratones inoculados.

Figura 4. Se inocularon 1.5x10⁶ células de ganglio drenante del tumor S13 (GLDT) con 1.5x104 células S13 en la almohadilla plantar de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) hasta el momento del sacrificio (16 días). El grosor del tumor se midió tres veces por semana con un calibre Mitutoyo. Los valores son promedios ± E.S. de 10 determinaciones.

Figura 5. las células LMM3 (2x10⁵) cocultivadas en MfT (2x10³) se inocularon en forma i.d. En ambos flancos de ratones normales. Los MfT fueron tratados con 10^{- 6} M de indometaciona y 5x10^-2 M de L-valina (Val). Los valores son promedios ± E.S. de 10 determinaciones.

La producción de NO, medida como NO^-2 se dterminó en sobrenadantes libres de células utilizando el reactivo de Griess; la actividad de arginasa se cuantificó en lisados celulares por un método enzimático colorimétrico y la actividad de COX se midió cuantificando la síntesis y liberación de PGE₂ por RIA. Los valores son promedios ± E.S. de 4 experimentos.

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