Introducción
Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en los países industrializados.¹ Entre los factores de riesgo implicados en el desarrollo y progresión de la aterosclerosis se destacan los niveles elevados de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL).² En este sentido, las estatinas han demostrado ser muy eficaces para corregir las anomalías lipídicas y reducir la mortalidad asociada.³ Sin embargo, en un porcentaje elevado de casos no se consigue reducir el colesterol LDL a los niveles deseados,⁴ por lo que resulta necesaria la búsqueda de nuevas aproximaciones terapéuticas. Por otra parte, resulta evidente que el tratamiento y la prevención de la enfermedad aterosclerótica deben implicar no sólo la corrección de los factores de riesgo, sino también el control farmacológico directo de los procesos que tienen lugar dentro de la propia pared arterial. Entre estos procesos resulta fundamental la acumulación de ésteres de colesterol en macrófagos mediada por el enzima acil-CoA:colesterol aciltransferasa (ACAT).⁵ La inhibición de esta enzima constituye una interesante diana terapéutica. Entre los inhibidores de la ACAT más conocidos se halla el compuesto CI- 1011,⁶ sintetizado originalmente por Parke-Davis, actualmente integrada en Pfizer Global Research and Development. Este compuesto, denominado avasimibe, es el inhibidor de la ACAT que se halla en una fase más avanzada de estudios clínicos (fase III).⁷
En un estudio reciente de nuestro grupo de investigación⁸ demostramos en macrófagos de origen humano que la adición de avasimibe durante el proceso de carga lipídica (incubación simultánea con el fármaco y LDL modificadas por acetilación) producía una disminución, dependiente de la concentración, en el contenido intracelular de ésteres de colesterol. Este efecto no se acompañaba de un incremento en el contenido intracelular de colesterol libre. Teniendo en cuenta la citotoxicidad que se deriva de la acumulación de colesterol libre en macrófagos,^9-11 los resultados anteriores sugieren un mejor perfil de seguridad para avasimibe, en comparación con otros inhibidores de la ACAT.⁷
La exposición de macrófagos a LDL modificadas, que constituyen un entorno proaterógeno y proinflamatorio, produce modificaciones en la expresión de un gran número de genes. Esta alteración en el patrón de expresión génica puede ser modificada, o revertida en cierto grado, por la exposición de dichas células a fármacos como los inhibidores de la ACAT. Hasta el momento, los estudios de modificación de la expresión génica se realizaron, en la mayoría de los casos, a través del estudio individual de un determinado gen o proteína. Sin embargo, probablemente existen numerosos genes cuya participación en el proceso aterosclerótico no se ha identificado todavía. A lo largo de los últimos 10 años se desarrollaron progresivamente tecnologías útiles para el escrutinio de grandes cantidades de genes de manera simultánea. Los arrays de ADNc utilizados son comerciales y están constituidos por membranas de nailon en las que se han depositado fragmentos de ADNc que son hibridados a sondas radiactivas [³²P] obtenidas de tejidos o células tratadas en diferentes condiciones. La intensidad de las marcas correspondientes a cada gen es proporcional al nivel de expresión de este gen en la célula en una situación determinada.
En el trabajo que se presenta a continuación se estudió el efecto de avasimibe sobre el perfil de expresión génica en macrófagos THP-1 expuestos simultáneamente al fármaco y a LDL oxidadas, con la finalidad de identificar genes regulados por este fármaco que puedan estar implicados en el desarrollo de la lesión aterosclerótica.

Materiales y métodos
Las células monocíticas THP-1 se diferenciaron a macrófagos por exposición a PMA (0.1 μM, 24 h). Los macrófagos se trataron durante 24 h con vehículo, LDL oxidadas (100 μg/ml) o con LDL oxidadas en presencia de avasimibe 2 μM (donación de Pfizer).
El perfil de expresión génica se analizó por hibridación a arrays de ADNc (Atlas Human Cardiovascular Array, BD-Clontech®). Para ello, las células se recogieron y se preparó RNA total mediante el procedimiento recomendado por BD- Clontech®). Las sondas radioactivas de ADNc se prepararon a partir de 5 μg de RNA total. El RNA se hibridó 2 min a 70ºC seguido de 2 min a 50ºC con 1 μl de la mezcla específica de primers, correspondiente a los genes presentes en el array de ADNc. La reacción de RT se llevó a cabo utilizando MMLV RT y 30 μCi de [α-³²P]dATP durante 25 min a 50ºC. Después de filtrar los nucleótidos no incorporados a través de columnas de Sephadex G-50, los ADNc marcados se hibridaron a las membranas utilizando ExpressHyb (BD-Clontech®) en un horno de hibridación a 68ºC durante la noche. Al día siguiente, las membranas se lavaron y se contactaron con pantallas de europio durante 10 a 14 días. Las pantallas se escanearon con un Phosphorimager (Modelo Storm, de Molecular Dynamics).
La cuantificación se llevó a cabo mediante el programa Atlas Image 2.01 (Clontech) y el análisis mediante el programa GeneSpring 5.0 de Silicon Genetics. Para cada gen, se calculó la intensidad corregida tras restar el fondo. La normalización global de las membranas se realizó por el método de la mediana, aplicando el percentil 50%. La expresión de cada gen se calcula a partir del cociente (ratio) del valor obtenido para cada tratamiento en relación al control, después de normalizar los datos. Las listas de restricción se generaron descartando aquellos genes cuya expresión diferencial fuera menor que el doble del background mínimo.

Resultados
En primer lugar, con el fin de identificar los genes afectados por la exposición de las células a un entorno proaterógeno, se realizaron incubaciones de los macrófagos con LDL oxidadas (100 μg/ml, durante 24 horas). Se llevaron a cabo 3 cultivos diferentes, con lotes distintos de células y de LDL oxidadas. Únicamente se consideraron aquellos genes cuya expresión resultó inducida o inhibida más de 2 veces de forma significativa (p < 0.05) a partir de los valores de los 3 arrays realizados. La exposición a LDL oxidadas inhibió la expresión de 22 genes, mientras que un total de 5 genes resultaron inducidos (Tabla 1). Para validar los resultados obtenidos se analizó la expresión a ARNm por RT-PCR de una serie de genes seleccionados por su potencial relación con el proceso aterosclerótico. Se confirmó que la exposición a LDL oxidadas incrementó 2.3 veces los niveles de ARNm del receptor scavenger CD68, 8.5 veces los correspondientes a la FABP4 (fatty acid binding protein 4) y redujo un 40% los de la metaloproteinasa 9 (MMP9) (Figura 1).

  Tabla I

Tabla 1. Genes diferencialmente expresados en macrófagos THP-1 tratados con oxLDL. La tabla muestra el nombre y el número de Genbank de los genes que resultaron diferencialmente expresados en células expuestas a LDL oxidadas (tratadas) respecto de las células tratadas con vehículo (control). La tercera columna corresponde a la expresión relativa de cada gen, calculada como la relación entre la intensidad ajustada de las células tratadas respecto de las controesl. La última columna indica la categoría funcional a la cual pertenece cada gen. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes realizados con diferentes lotes de células y lipoproteínas.

Figura 1. Análisis de los niveles de ARNm de FABP4, CD18 y MMP9 mediante RT-PCR de macrófagos THP-1 tratados con LDL oxidadas durante 24 horas. Se muestra una autorradiografía representativa y la cuantificación de dichos niveles de ARNm normalizados respecto de los del gen de la tubulina 1 (TUBA1). Los resultados se expresan en unidades arbitrarias como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados con diferentes lotes de células y de lipoproteínas. * p < 0.05.

Tabla 2. Genes diferencialmente expresados en macrófagos THP-1 tratados con avasimibe. La tabla muestra el nombre y el número de Genbank de los genes que resultaron diferencialmente expresados en células expuestas a avasimibe (2 μM durante 24 horas) en presencia de LDL oxidadas (tratadas) respecto de las células incubadas únicamente con estas LDL (control). La tercera columna corresponde a la expresión relativa de cada gen, calculada como la relación entre la intensidad ajustada de las células tratadas respecto a las controles. La última columna indica la categoría funcional a la cual pertenece cada gen. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes realizados con diferentes lotes de células y lipoproteínas.

Figura 2. Análisis de los niveles de ARNm de FABP4 mediante RT-PCR de macrófagos THP-1 tratados con avasimibe (2 μM durante 24 horas) en presencia de LDL oxidadas respecto de las mismas células incubadas únicamente con estas LDL. Se muestra una autoradiografía representativa y la cuantificación de dichos niveles de ARNm normalizados respecto de los del gen de la tubulina 1 (TUBA1). Los resultados se expresan en unidades arbitrarias como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados con diferentes lotes de células y de lipoproteínas. ** p < 0.01.

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Antecedentes

El sistema del complemento (C) es una de las vías principales por las que el reconocimiento del antígeno se convierte en una defensa efectiva contra la infección, lo que es particularmente importante en la protección contra bacterias extracelulares.¹ Este sistema está formado por un gran número de diferentes proteínas plasmáticas, la mayoría de las cuales circulan como cimógenos que se activan en forma secuencial a través de una cascada de reacciones enzimáticas. Una de las vías más comunes de activación del C es la vía clásica, la cual se inicia por la unión de complejos antígeno-anticuerpo al componente C1 del C. Tanto la participación exagerada como disminuida del sistema del C puede llevar a enfermedad. Comprender el mecanismo de modulación de la actividad de este sistema podría contribuir a contrarrestar alteraciones patológicas de su función. En los últimos años nos hemos dedicado a estudiar el efecto modulador in vitro de la bilirrubina sobre la activación del C, particularmente por la vía clásica, y sus consecuencias in vivo en animales de experimentación.

En los vertebrados, el grupo hemo de la hemoglobina se degrada primariamente a los pigmentos biliares biliverdina (BV) y bilirrubina (BR), aunque pueden existir vías alternativas de degradación y también puede ser excretado en bilis sin cambios.² La BV representa un intermediario importante en la síntesis de BR, su conversión en BR es mediada por un proceso de reducción, muy eficiente en mamíferos. Como resultado, la mayor parte de los pigmentos biliares excretados en bilis están representados por BR, particularmente en forma de conjugados con ácido glucurónico. Es interesante destacar que la BR en la bilis se reconvierte rápidamente a BV por oxidación espontánea, si la BV es derivada fuera del organismo.

Estudios recientes indican que la BV es capaz de inhibir la activación del C por la vía clásica.³ Esto puede explicar la utilidad del uso de la bilis de buey, rica en BV, como medicamento antialérgico por parte la medicina tradicional china. Sin embargo, el hecho de que BV se convierta rápidamente en BR una vez incorporada exógenamente a los mamíferos,⁴ sugiere que su efecto anticomplementario podría estar mediado esencialmente por la BR. De ser así, surge entonces un interrogante: ¿podría el sistema del C estar alterado en humanos en situaciones de ictericia?

Para evaluar esta posibilidad, en una primera etapa realizamos estudios in vitro comparando la acción inhibitoria de la BR y la BV sobre la activación del C de origen humano por la vía clásica. Los resultados, publicados en 1999,⁵ indicaron que el efecto inhibitorio de la BR (a) fue mayor que el de la BV, (b) se localizó sobre el componente C1 de la cascada del C, (c) involucró la etapa de unión entre el anticuerpo (tanto IgM como IgG) y el subcomponente C1q del C1 y, (d) fue mayor para la BR no conjugada que para su derivado conjugado con ácido glucurónico. Todos estos efectos fueron dependientes de la dosis y se manifestaron a concentraciones de BR superiores a las fisiológicas, específicamente por encima de 34 µM (2 mg/dl). Estos resultados confirmaron nuestra hipótesis sobre el efecto inhibitorio de la BR sobre el sistema del C. Claramente, el efecto podría tener alguna implicancia en el organismo intacto, aunque fundamentalmente en situaciones de ictericia con aumento de BR no conjugada.

En una segunda etapa, y para verificar que la BR no conjugada era capaz de inhibir la activación del C in vivo, desarrollamos un protocolo experimental en la rata. Dicho protocolo permitió evaluar la activación intravascular del C por la vía clásica, a través de la detección de la hemoglobina liberada por lisis de eritrocitos de carnero transfundidos a ratas Wistar portadoras de anticuerpos heterófilos. Los resultados, publicados en 2002,6 mostraron que la BR no conjugada fue capaz de atenuar la activación del C, su efecto fue dependiente de la dosis y, como era de esperar, sólo visible en concentraciones superiores a las fisiológicas.

En función de los primeros estudios que mostraron que la BR interfiere la unión de IgM o IgG a C1q, surgió el interés de probar si el pigmento podría unirse directamente a C1q, en el sitio (o próximo al sitio) de unión de las inmunoglobulinas, compitiendo así con IgM o IgG por la unión a C1q. En la etapa más reciente de nuestro estudio analizamos la interacción de la BR con C1q mediante la técnica de espectrofotometría diferencial. Los resultados se presentan a continuación en forma sintética.

Interacción de BR con C1q
La BR es un pigmento amarillo que presenta un espectro de absorción específico con un pico máximo a aproximadamente 450 nm. Desde hace años se sabe que al interaccionar con ciertas proteínas, el pico del espectro de la BR puede cambiar de posición. Este cambio, específicamente estudiado para la interacción con albúmina sérica, se debe a una transformación estructural en la molécula del pigmento que conlleva a cambios en sus propiedades fisicoquímicas, incluido el espectro de absorción. Técnicamente, el procedimiento consiste en evaluar el espectro de absorción del pigmento, antes y después de agregar la proteína de unión en concentraciones crecientes. El resultado se visualiza como la resta de los espectros con proteína y sin proteína, tal como se muestra en la figura 1 para la albúmina sérica humana (ASH). Así, el corrimiento del pico de absorción de la BR en presencia de ASH hacia la derecha (Fig. 1A) se traduce, al realizar el espectro diferencial, en una curva de valores negativos y luego positivos conforme aumenta el valor de longitud de onda (Fig. 1B). Un corrimiento en el espectro de absorción de la BR en presencia de C1q confirmaría nuestra presunción acerca de una interacción específica entre ambos.

Figura 1. Construcción del espectro diferencial de bilirrubina. El panel A muestra el desplazamiento del espectro de absorción de bilirrubina (BR) hacia longitudes de onda mayores en presencia de albúmina sérica humana (ASH). Al restar de este último el primero se obtiene el espectro diferencial (panel B), indicativo de interacción específica entre el ligando (BR) y la proteína (ASH). El mismo se registra como cambios de densidad óptica en función de los cambios de longitud de onda.

El análisis del espectro de absorción de la BR en presencia de C1q se realizó a 25°C en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 2 S, doble haz. La BR se disolvió en un volumen mínimo de NaOH 0.1 N y se diluyó en solución de Mayer conteniendo concentraciones apropiadas de Ca²⁺ y Mg²⁺. Para las mediciones de absorbancia diferencial, el mismo volumen de la solución de BR fue pipeteado en dos cubetas diferentes. Luego se agregaron volúmenes crecientes de una solución de C1q de origen comercial (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, EE.UU.) o de solución de buffer Tris 0.150 M, NaCl 1.5 M; pH 7.3 (solvente de C1q), en la cubeta para muestra y en la de referencia, respectivamente. Como controles positivos y negativos se analizaron los espectros de absorción diferenciales de la BR en presencia de ASH o IgG humana respectivamente, ya que en experimentos preliminares observamos que la IgG no interacciona con la BR.

Los resultados se muestran en la Fig. 2. Se observa que C1q es capaz de unirse a la BR, al modificar su espectro de absorción y confirmar una interacción específica, no presente para el control negativo IgG. Se desprende de los mismos resultados que las concentraciones de C1q (margen derecho de la figura) necesarias para producir el desplazamiento del espectro fueron menores que las de ASH necesarias para producir un desplazamiento de magnitud similar. Esto sugiere mayor afinidad de la BR por C1q que por ASH. Esta observación podría explicar por qué el pigmento fue capaz de inhibir la activación del C en animales in vivo, aun cuando, como es sabido, las concentraciones fisiológicas de albúmina sérica son muy superiores a las de C1q.

Figura 2. Espectro diferencial de bilirrubina en presencia de C1q. Se muestra el espectro diferencial de bilirrubina (BR) ante el agregado de concentraciones crecientes de C1q (margen derecho) y de los controles positivo (albúmina sérica humana, ASH) y negativo (inmunoglobulina G humana, IgG). El estudio demuestra interacción entre C1q y BR, aunque con un perfil cualitativamente y cuantitativamente diferente del de la interacción ASH-BR. Como era de esperar, IgG no modificó el espectro de absorción de BR, lo que indica ausencia de interacción entre ambas.

Se ha demostrado que la BR se une a grupos amino de lisina presentes en la ASH a través de interacciones electrostáticas del tipo dipolo-dipolo. Se sabe además que C1q es una de las proteínas más básicas del organismo debido a su elevado contenido en arginina e hidroxilisina. Nuestro modelo para explicar los hallazgos observados hasta el presente se muestra en la Fig. 3 y plantea que la BR, en particular en su forma no conjugada y a concentración superior a la fisiológica, se une a C1q en algún sitio de su cabeza globular (crítico para la unión de inmunoglobulinas), muy probablemente a través de uniones dipolo-dipolo, inhibiendo así el inicio de la activación de C1 y, por ende, la activación de la vía clásica del C. La interacción normal entre las cabezas globulares de C1q y la región Fc de las inmunoglobulinas (panel A), en el ejemplo de la Fig. 3, unidas a antígenos de superficie, no puede producirse si se une BR a C1q (panel B).

Las propiedades anticomplementarias de la BR podrían atenuar la lesión celular mediada por C en patologías tales como las anemias hemolíticas autoinmunes,⁷ la hepatitis B aguda^8,9 o el rechazo hiperagudo de un trasplante hepático ABO incompatible.¹⁰ En contrapartida, si se considera la participación del C en la defensa contra bacterias y virus, la hiperbilirrubinemia podría contribuir a incrementar la susceptibilidad a infecciones, especialmente en situaciones donde la síntesis hepática es deficiente, tales como en las enfermedades hepáticas crónicas¹¹ o en el recién nacido.¹² Todas las alteraciones mencionadas cursan con niveles elevados de BR (fundamentalmente en su forma no conjugada) y por ello las proponemos como ejemplos posibles de inhibición de la actividad del C por exceso de pigmento. Nuestros estudios siempre han sido básicos y desafortunadamente, hasta el momento, no se ha realizado ningún estudio poblacional en pacientes que permita confirmar nuestras presunciones.

Por su propia naturaleza, nuestros estudios en cambio podrían contribuir al conocimiento de los mecanismos que modulan negativamente la acción del C, y con ello al mejoramiento de estrategias terapéuticas para mitigar los efectos inflamatorios en enfermedades que cursan con activación del C. Por ejemplo, es de destacar que algunos medicamentos actúan atenuando los síntomas en enfermedades que cursan con un componente inflamatorio, a través de su acción anticomplementaria. Al ejemplo de la bilis de buey antes mencionado debe agregarse el del extracto de raíz de Glycyrrhiza glabra (regaliz). Sus propiedades antiinflamatorias y antialérgicas se atribuyen a uno de sus principales componentes, el ácido <β>-glicirretínico. En un estudio reciente, Kroes y col. (1997) demostraron que este componente, de estructura esteroidea, posee la capacidad de inhibir la activación del C por la vía clásica. Esta propiedad resultó estrictamente dependiente de la estructura conformacional del compuesto, ya que el isómero alfa no mostró propiedades anticomplementarias. Posteriormente, un estudio mecanístico reveló que el ácido <β>-glicirretínico actúa a través de sus propiedades modulatorias sobre el componente C2 del sistema del C.¹³ Por otra parte, la inhibición terapéutica de la cascada del C a nivel de C5 con anticuerpos específicos puede impedir la formación del potente péptido anafilotóxico y quimiotáctico C5a atenuando las reacciones inflamatorias mediadas por C.¹⁴ Al respecto, en un modelo murino de lupus eritematoso sistémico se demostró que la terapia con anti-C5 monoclonal resultaba en una disminución significativa de la progresión de la glomerulonefritis lúpica y en un marcado aumento de la sobrevida de los animales.¹⁵ Finalmente, teniendo en cuenta que la actividad anti-C5 es retenida por el fragmento variable del anticuerpo, surge la posibilidad de diseñar pequeñas moléculas de características análogas a estas secuencias peptídicas con actividad antiinflamatoria.¹⁶ Así, el estudio de la modulación de las propiedades inflamatorias del C representa un campo atractivo y poco explorado aun para el tratamiento de diversas enfermedades. Nuestra contribución en particular abre una expectativa sobre la posibilidad de explotar la interacción de moléculas pequeñas con la subunidad C1q, punto clave en el disparo de la activación del C por la vía clásica. La estructura de la BR puede ser un marco de referencia inicial.

Agradecimientos
Los autores desean expresar su gratitud a los Dres. Guillermo Picó, José M. Pellegrino, Bibiana Nerli y Diana Romanini por su generosa colaboración. Los estudios informados en el artículo fueron realizados con el apoyo de Universidad Nacional de Rosario, CONICET, ANPCyT y Fundación Antorchas, Argentina.

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