Introducción
La importancia creciente de los moluscos como proteínas para consumo, junto con la estabilización de la producción pesquera mundial, ha llevado a un desarrollo importante de este campo de la acuicultura. En los últimos años, tanto el número de explotaciones de cultivo de moluscos como su volumen de producción se incrementaron notablemente en nuestro país y sobre todo en Galicia, debido al amplio mercado de este producto. Dicho incremento en el consumo conlleva un problema sanitario asociado, ya que en el medio acuático donde se desarrollan estos organismos se pueden encontrar más de 100 especies distintas de virus infecciosos para el ser humano, que normalmente se transmiten por vía fecal-oral y que se denominan genéricamente "virus entéricos".^1,2

La contaminación viral de los moluscos
La prevalencia de los virus entéricos en el ambiente depende de varias causas, pero fundamentalmente de la contaminación humana por aguas fecales, ya que las partículas virales son vertidas al medio con las heces de los individuos afectados, donde se encuentran en elevadas cantidades. A través de las aguas residuales, estos virus acceden a todo tipo de aguas superficiales, donde representan un serio riesgo sanitario.^3-5
Los moluscos son organismos filtradores, se demostró que el flujo que atraviesa su tracto digestivo puede alcanzar los 20 litros en una hora. Como consecuencia de este flujo se retienen todo tipo de partículas sólidas, muchas de las cuales son flóculos sedimentarios que pueden transportar partículas virales adheridas, o bien partículas virales libres.⁶ Así, moluscos como mejillones, lapas, berberechos, almejas y ostras actúan a modo de concentradores virales naturales. Aunque esta bioacumulación es pasiva (los virus entéricos no se multiplican en el interior del molusco), las partículas víricas se pueden acumular en diferentes órganos y tejidos del molusco, donde permanecen estables durante largos períodos de tiempo. El hecho de que muchos de estos moluscos se consuman crudos o sólo mínimamente cocinados es una de las causas de que estas partículas virales lleguen perfectamente viables a los consumidores y sean capaces de producir enfermedad.
Todo lo anteriormente descrito explica por qué estos organismos filtradores actúan a modo de vectores en la transmisión de enfermedades como hepatitis infecciosa, causada por el virus de la hepatitis A (HAV), gastroenteritis (principalmente cusadas por Norovirus [NV]), etc. (tabla 1). Este hecho está, además, potenciado por el crecimento de moluscos en áreas típicamente contaminadas por la influencia del hombre, lo cual implica un riesgo serio para la salud pública y la necesidad de una vía de prevención de esta transmisión.

Tabla 1

Generalmente, los moluscos responsables de los brotes y epidemias virales provienen de zonas de aguas contaminadas, pero no es infrecuente que procedan de áreas de agua de "buena calidad"; según las exigencias sanitarias actuales, para aguas de cultivo de moluscos únicamente se incluyen normativas en cuanto al número de coliformes fecales y presencia de Escherichia coli.⁷ Por ello, una de las líneas de investigación que más se potenció se dirige al desarrollo de técnicas para una detección viral eficaz, tanto a partir del agua y sedimentos como de tejidos de organismos.

Control sanitario
Como ya se comentó, la normativa en vigor sobre control sanitario de moluscos destinados a consumo se basa en la determinación de los niveles de coliformes fecales y E. coli presentes, bien en carne y líquido intervalvar de los moluscos, bien en las aguas de cultivo.
Actualmente, según los criterios de la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 1991 (91/142/CEE),⁸ la calidad sanitaria de los moluscos se fija según una clasificación de las zonas de producción en función del número de coliformes fecales y E. coli, de la siguiente forma.
Zonas A: Para consumo humano directo. Moluscos con menos de 300 coliformes fecales o menos de 230 E. coli por 100 g de carne y líquido intervalvar.
Zonas B: Moderadamente contaminados. Moluscos con menos de 6 000 coliformes fecales o menos de 4 600 E. coli por 100 g de carne en el 90% de las muestras tomadas. Sólo se pueden destinar a consumo después de tratamiento en un centro de depuración o tras su reinstalación en una zona A.
Zonas C: Fuertemente contaminados, molucos con menos de 60 000 coliformes fecales por 100 g de carne de molusco. Se podrían destinar a consumo tras un largo período de reinstalación en una zona limpia.
Sin embargo, diversos trabajos demostraron que no existe una buena correlación entre la presencia viral y bacteriana, la persistencia viral es mucho más elevada que la bacteriana, tanto en moluscos como en el medio ambiente. Por tanto, el uso de coliformes fecales como indicadores de presencia viral no es fiable.^{9- 13}
En este sentido, nuestro grupo de investigación realizó diferentes estudios sobre la prevalencia de diferentes virus entéricos en poblaciones naturales y cultivadas de moluscos en Galicia (noroeste de España).^9,13 En el primero de ellos,⁹ se estudió la prevalencia de HAV y enterovirus mediante las técnicas de hibridación dot-blot y RT-PCR, comparando los valores de contaminación viral con los de contaminación bacteriana, evaluados mediante recuentos de E. coli en las mismas muestras. Entre las especies de moluscos estudiadas figuraban mejillón, natural y cultivado en batea, almeja y berberecho. Los recuentos bacterianos mostraron que la mayoría de las muestras (40.8%) se clasificaban como moderadamente contaminadas según los estándares de la UE (categoría B), y por lo tanto debían someterse a procesos de depuración (tabla 2). Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre los valores de contaminación bacteriana de mejillón cultivado y los de moluscos silvestres. Así, el porcentaje de muestras limpias (< 230 E. coli/100 g de molusco) fue claramente superior en mejillón cultivado (49.1%) que en mejillón silvestre (22.8%) o almejas y bereberechos (10.7%). Por otro lado, se detectó HAV en 27.4% de las muestras y enterovirus en 43.9% (tabla 2). La detección simultánea de ambos tipos virales se obtuvo en 14.1% de las muestras. En este sentido, también se demostró que la técnica de RT-PCR es más sensible y eficaz para la detección de HAV. Los análisis estadísticos realizados mostraron que no existía correlación entre la contaminación bacteriana y viral, ni entre la presencia de HAV y enterovirus. Únicamente pudo encontrarse dicha relación en áreas muy contaminadas, normalmente asociadas a zonas con elevada concentración de población.



En el segundo de los trabajos¹³ se amplió el número de grupos virales a estudiar incluyendo NV y adenovirus (AV) y se evaluó la validez de los bacteriófagos RNA F+ como indicadores de contaminación viral. En este estudio se utilizó la técnica de nested-PCR para aumentar la sensibilidad en la detección viral. Los resultados de los recuentos de E. coli mostraron de nuevo una menor contaminación en los moluscos cultivados (62.5% de las muestras en categoría A) que en los obtenidos de poblaciones naturales (0 en categoría A) (tabla 2). Por niveles de bacteriófagos, únicamente 37.5% de las muestras de moluscos cultivados se podrían considerar limpias, mientras que el 100% de las muestras de poblaciones naturales estarían consideradas como contaminadas (tabla 2). Con respecto a los niveles de los diferentes grupos de virus entéricos, 66.6% de las muestras fueron positivas para AV y 16.6% para NV (tabla 2). Es interesante señalar que se detectaron ambos genogrupos (I y II) de Norovirus, incluso en una misma muestra. No se encontraron muestras positivas para HAV, probablemente debido al rápido descenso de la incidencia de este virus en España.¹⁴
Los resultados obtenidos en estos dos estudios son similares a los descritos por otros autores,^10-12 e indican la necesidad de utilización de nuevos indicadores más fiables o bien de realizar análisis específicos de contaminación viral.^7,15 En este sentido, es importante señalar que el Consejo de la Unión Europea adoptó en 1999 una Decisión (1999/313/CE)¹⁶ vinculante para todos los países miembro, en la que se establece la necesidad de estandarización e inclusión en la normativa de métodologías adecuadas para el control virológico de moluscos bivalvos.
Depuración
El método tradicional utilizado para prevenir la posible contaminación bacteriana o viral de moluscos es el de depuración, consistente en la colocación del molusco en agua no contaminada o limpia durante 48 horas como término medio, se basa en la capacidad autopurgante de los moluscos por sus características de organismos filtradores.^17-19 Un gran número de trabajos publicados en los últimos años demostraron que las reducciones en el número de coliformes fecales y virus (particularmente HAV) tras el proceso de depuración no están muy relacionadas.^12,20-23 Teniendo esto en cuenta, parece que la efectividad de la depuración necesita ser evaluada por separado para cada grupo de patógenos.
Recientemente nuestro grupo de investigación llevó a cabo estudios comparativos de las dinámicas de depuración de diferentes microorganismos en mejillón,²⁴ incluyendo E. coli y bacteriófagos RNA F+, como ejemplo de microorganismos indicadores, y los virus HAV y NV. Los resultados mostraron la falta de correlación entre los niveles de E. coli y bacteriófagos, así como entre los niveles de ambos indicadores y la presencia viral (tabla 3), lo que indica la existencia de dinámicas de eliminación diferentes y la necesidad de más estudios para determinar las condiciones idóneas del proceso de depuración para que pueda asegurar un producto de calidad virológica destinado a consumo. Además, se observó que en algunas se incrementan los niveles de contaminación tras el proceso de depuración, lo que puede deberse a malas prácticas operacionales durante el proceso (tabla 3). Es necesario por tanto un mayor control del funcionamiento de las plantas depuradoras de moluscos.



Papel de las importaciones y otras operaciones comerciales en la transmisión de virus entéricos
En los últimos años se demostró la importancia de las operaciones comerciales internacionales en la transmisión de patógenos asociados al consumo de determinados alimentos. Un buen ejemplo de la implicación de estas operaciones en la aparición de brotes epidémicos es el brote de hepatitis A ocurrido en España, que pudo asociarse al consumo de almejas coquinas (Donax sp.) importadas de Perú, que es una zona endémica para esta enfermedad.²⁵ Los primeros casos del brote se registraron en septiembre de 1999 y se dio por concluido a finales del mismo año. El número de personas afectadas fue de 188, todas en la Comunidad Valenciana, en las que se observaron varios casos de gastroenteritis, vómitos, dolores abdominales y fiebre. Los análisis virológicos realizados mediante métodos moleculares a partir de tejidos de las almejas implicadas demostraron la presencia del HAV en 75% de las muestras. Sobe la base de estas evidencias, las autoridades sanitarias autonómicas y estatales procedieron a la inmovilización de 176 544 kg de coquinas en la Comunidad Valenciana y 12 544 kg en el resto de España.
A partir del brote de hepatitis A ocurrido en la Comunidad Valenciana, y pese a no existir legislación al respecto, las autoridades sanitarias españolas adoptaron como medida preventiva el análisis sistemático de las importaciones de moluscos, principalmente almejas (Donax sp. y Tapes sp.) y vieiras (Argopecten sp.), para la detección del HAV. Nuestro laboratorio en la Universidad de Santiago realizó, entre noviembre de 1999 y mayo de 2001, el análisis virológico específico para el virus de la hepatitis A de un total de 16 importaciones de moluscos bivalvos procedentes de Sudamérica llegadas a distintas comunidades autonómicas españolas.²⁶ Estas importaciones incluían 6 envíos de almeja fina (Tapes sp.), 6 de coquinas, así como 5 de vieiras, que tomadas en conjunto implicaban un volumen de importación de 300 toneladas de moluscos. Además, se analizaron las muestras inmovilizadas en la Comunidad Valenciana asociadas con el brote de hepatitis A ocurrido en septiembre de 1999.
De las 16 importaciones analizadas, en 3 de ellas se demostró la presencia de HAV mediante la técnica de RT-PCR (amplificación del ácido nucleico viral extraído de tejidos de molusco) combinada con hibridación de los productos de amplificación con sondas específicas para el virus. De estas importaciones, dos se correspondieron con lotes de almeja fina, mientras que la tercera consistía en un envío de vieiras (figura 1).

Figura 1. Detección del virus de la hepatitis A en moluscos procedentes de importaciones, por RT-PCR (A) y correspondiente Southern blot (B). Líneas: a, marcador de peso molecular (PCR marker 50-2 000 bp, Sigma); b-e, muestras de almeja; f-h, muestras de vieira; i, control negativo; j, control positivo. Los números indican la talla en pb de las bandas del marcador (izquierda) y el producto específico (derecha).

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A hepatite auto-imune (HAI) é uma doença inflamatória crônica do fígado de etiologia desconhecida, que evolui, freqüentemente, para cirrose hepática, na ausência de tratamento imunossupressor. A doença acomete, usualmente, pacientes jovens do sexo feminino e caracteriza-se pela presença de hipergamaglobulinemia, autoanticorpos circulantes não-órgão específicos e alterações histológicas no parênquima hepático caracterizadas pela presença de hepatite de interface com infiltrado inflamatório composto preponderantemente por linfócitos T ativados e plasmócitos.^1-3
A característica de um processo auto-imune é a reatividade anômala dirigida contra alvos antigênicos nos próprios tecidos do indivíduo. Apesar de manifestações extra- hepáticas auto-imunes ocorrerem em cerca de 10%-30% dos pacientes com HAI, o órgão-alvo da lesão é o fígado e os hepatócitos periportais são as células preponderantemente envolvidas. Nas células apresentadoras profissionais como células dendríticas, macrófagos ou células de Kupffer, ocorre a apresentação dos antígenos através das moléculas HLA aos linfócitos T de fenótipo auxiliador. Na presença de sinais co-estimulatórios, o reconhecimento de peptídeos antigênicos pelos receptores de linfócitos T (RCT) levam a sua ativação, proliferação com formação de clones e produção de citocinas e fatores que auxiliarão no recrutamento de outras células.⁴ Os linfócitos T do tipo auxiliador (CD4+) são as células que orquestram a resposta imunológica que inclui linfócitos T CD8+ (citotóxicos); linfócitos B e plasmócitos (células secretoras de anticorpos) e macrófagos. Clones T CD4+, infiltrantes no fígado de pacientes com hepatite auto- imune já foram identificados sem, no entanto, compartilhar um padrão único de RCT nos diversos pacientes.^5-7 Por outro lado, vários auto- anticorpos órgão específicos e não-órgão específicos já foram identificados em pacientes com HAI, mas sua relevância na patogênese da doença é controversa. Os anticorpos contra microssoma de fígado e rim do tipo 1, citosol hepático do tipo 1, antígeno hepático solúvel e receptor da asialoglicoprotéina reconhecem, respectivamente, epitopos do CYP2D6, da formiminotransferase ciclodeaminase, do receptor da asialoglicoproteína (glicoproteína de membrana hepatocelular) e de uma ribonucleoproteína. A maioria dos outros auto-anticorpos associados à HAI reconhecem proteínas citoplasmáticas e antígenos nucleares ubiquitários.
Os outros elementos que protagonizam a resposta auto-imune são as moléculas HLA que apresentam os peptídeos. Estas têm sido os alvos sistemáticos dos estudos que buscam identificar os responsáveis pelo desencadeamento da HAI.
A prevalência da HAI não foi adequadamente estudada. Estima-se que cerca de 10% dos pacientes com doença hepática crônica seja portador de HAI.⁸ Ocorre esporadicamente em habitantes de certas regiões do Mediterrâneo e em países asiáticos, sendo freqüente no Norte da Europa⁹ e Austrália.¹⁰ No Brasil, a HAI é considerada uma causa rara de doença hepática crônica, compreendendo cerca de 5%-10% das doenças hepáticas nos principais centros de gastroenterologia do país.^11,12 A classificação dos sub-tipos, aceita pela maioria dos autores^13,14 baseia-se na presença de auto-anticorpos sem especificidade para determinado órgão e que não aparentam ser patogênicos.^1,15,16 O tipo1 (HAI-1) ocorre quando há positividade para anticorpo anti-músculo (AAML), particularmente para anticorpo anti-actina (AAA), associado ou não a anticorpos antinucleares (AAN) e o tipo 2 (HAI-2) quando há positividade para anticorpo anti-microssomal fígado-rim-1 (AAMFR-1) e/ou para o anticorpo anticitosol hepático do tipo 1 (AACH1). Uma terceira variante de HAI caracterizada pela presença de auto-anticorpos dirigidos contra UDP- glucuronosyl-transferase foi recentemente proposta não sendo aceita pela maioria dos autores como um subtipo particular da doença.¹⁷
A classificação da HAI é sustentada pela heterogeneidade clínica da doença. Os pacientes com HAI-2, quando comparados aos portadores de HAI-1, apresentam características peculiares no início da enfermidade, tais como: menor idade, maior freqüência de hepatite fulminante, níveis mais elevados de bilirrubinas e de aminotransferases e mais reduzidos de gamaglobulinas.^8,12,18 O tipo 2 é também mais raro que o tipo 1, sendo descrito particularmente em crianças da Europa Ocidental e América do Sul. Ambos os tipos apresentam resposta semelhante ao tratamento imunossupressor.¹³
Os dois tipos principais de HAI são diferentes também no perfil imunogenético. A predisposição genética é primariamente associado ao gene HLA- DRB1.¹⁹ Na Europa e Estados Unidos estudos mostraram associação do haplótipo HLA A1-B8-DR3 (DRB1*0301) e secundariamente ao HLA- DR4(DRB1*0401) com HAI-1.²⁰ No Japão e na China foi observada associação com HLA-DR4 (DRB1*0405).^21,22 Na Argentina, Fainboim et al.²³ observaram associação de HAI-1 com as especificidades HLA-DR13 (DRB1*1301) e DQ6. Na Argentina e no México também foi observada a associação, respectivamente, com alelos DRB1*0405 e DRB1*0404.^24,25 Já no Brasil, numa série de trabalhos conduzidos pelo nosso grupo^26-28 foi observada a associação primária da HAI-1 com HLA- DR13 (DRB1*1301) em adultos e crianças e associação secundária com HLA-DR3 (DRB1*0301). Por outro lado, nos pacientes com HAI-2, a associação com HLA-DR7 e secundariamente com DR3 estava presente, reforçando a noção da dicotomia dos tipos de HAI.²⁶
A diversidade na seqüência de aminoácidos presentes nos alelos do gene HLA-DRB1 associados à HAI-1 levou vários autores a proporem a existência de padrões ou motivos compartilhados na molécula HLA que permitiriam a apresentação de peptídeos antigênicos iguais ou muito semelhantes e como conseqüência, levariam ao desencadeamento da auto-imunidade e à instalação da doença.^{19,29- 32} No entanto, os padrões propostos levam em conta parte dos alelos associados não sendo possível estabelecer-se um padrão único.³³
A associação de HAI observada com genes HLA de classe II é uma das mais relevantes conhecidas, com riscos relativos sempre acima de 5, mas apenas em algumas formas clínicas há identificação do antígeno-alvo. O antígeno alvo na HAI- 2 já pode ser caracterizado, devido a presença de anticorpos dirigidos contra a isoforma 2D6 do citocromo P450.^34-36 Anti-CYP2D6 são encontrados em pelo menos 75% dos pacientes com HAI-2.^34,35 A reativididade contra outros antígenos alvo, tais como a glutationa S-transferase, receptor de asialoglicoproteína, citoqueratina 19, citosol hepático tipo 1, DNA e cromatina, já foi rastreada, mas parece se correlacionar melhor com a progressão da doença.^37-41 Por outro lado, não há até o momento confirmação da F-actina como auto-antígeno da forma mais freqüente de HAI, a tipo 1.⁴² Por fim, muitos destes auto-anticorpos não são específicos das hepatites auto-imunes, e na verdade, assim como com os anticorpos dirigidos contra a actina, são encontrados nas mais diversas manifestações de auto- imunidade.
Várias explicações são possíveis para as diferentes associações observadas. Por um lado, perfis clínicos e laboratoriais indicam uma heterogeneidade de formas de uma mesma doença, com indícios que os antígenos alvo possam de fato ser diferentes. Não pode ser descartada uma origem pelo mecanismo de mimetismo molecular com um patógeno ainda não identificado, que poderia também variar conforme a região ou país, levando ao reconhecimento cruzado e desencadeamento da auto- imunidade a partir de epitopos diferentes. O virus do herpes simples, do sarampo e das hepatites A e B já foram sugeridas.^16,43,44 Na Argentina, um curso clínico atípico de hepatite aguda por vírus A, de maior duração e com auto- anticorpos positivos, foi associado à presença de HLA-DRB1*1301,⁴⁵ inferindo-se que o vírus da hepatite A pudesse estar relacionado à presença de auto-anticorpos e mesmo ao desencadeamento de HAI. Contudo, a análise da prevalência de IgG para VHA nos pacientes brasileiros com HAI e em controles históricos, pareados por faixa etária, não demonstrou nenhum aumento significante na prevalência de infecção por VHA em pacientes com HAI, nem revelou freqüência aumentada de sorologia positiva para VHA em portadores de HAI com HLA- DRB1*1301 quando comparados a pacientes com outros antígenos HLA-DR (Bittencourt PL et al., dados não publicados).
Mesmo na ausência de um patógeno identificável, é possível que uma suscetibilidade anômala à lesão hepatocelular leve ao aparecimento, no próprio tecido hepático, de neo-antígenos ou antígenos crípticos, previamente seqüestrados ou escondidos, que se tornam então reconhecíveis. Esta poderia ser uma explicação para a forte presença da resposta humoral anti-músculo liso, que aparentemente reconhece estruturas do citoesqueleto, particularmente filamentos de actina polimerizada.^46-48 Componentes adicionais de suscetibilidade, como a presença de polimorfismos que alteram a transcrição de TNF alfa ou CTLA4 vem sendo também investigados, mas também mostram padrões regionais ora com associação positiva ora sem significância.^49-53 Assim, apesar dos grandes avanços já registrados no conhecimento da etiopatogenia da hepatite auto- imune, questões cruciais ainda permanecem não resolvidas: a natureza do auto- antígeno na HAI-1, o perfil mais completo de uma suscetibilidade genética que leva a auto-imunidade num órgão tradicionalmente considerado imuneprivilegiado e o papel de fatores ambientais e de patógenos no desencadeamento da doença.
Los autores no manifiestan conflictos.

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