Introducción
La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía inducida por prolaminas derivadas del cereal que afecta a individuos genéticamente susceptibles y en la que la inmunidad adaptativa desempeña un papel central al interactuar con factores ambientales, prol aminas y el haplotipo HLA-DQ2/8.
Debido a su contenido en prolina y glutamina, los péptidos de gliadina, luego de desaminarse, adoptan una configuración que favorece su unión con el HLA-DQ2 para así ser presentados a la lámina propia de las células T CD4, activándolas e induciendo liber ación de interferón gamma e inflamación intestinal. Por otro lado las prolaminas, como consecuencia de su alto contenido en prolina, muestran resistencia a la digestión por las enzimas presentes en la luz y en el ribete en cepillo de la célula del epitel io del intestino.
Modelos de digestión de alfa₂-gliadina identificaron un concatémero de 3 epitopes principales de células T contenidos en un péptido 33-mer (56-88) que es resistente a la digestión y una fuente estimulante de las células T CD4⁺ en pa cientes con EC.
La inmunidad innata, representada por la interleuquina 15, promueve hiperplasia de los linfocitos intraepiteliales, maduración de células dendríticas y presentación de epitopes de células T con contenido de gliadina a los linfocitos CD4 de la lámina prop ia intestinal de pacientes con EC. Esta citoquina se produce masivamente en la EC activa y su expresión puede ser desencadenada en cultivos de preparados de intestino de pacientes con EC que se hallan con dieta sin gluten, por el péptido 31-49. En divers os estudios se corroboró la toxicidad de este péptido para la mucosa de pacientes con EC.
El único tratamiento eficaz y seguro de la EC es la dieta sin gluten, pero su implementación resulta poco práctica y se asocia con poca adhesión; hechos que obligan a la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas. Dado que las gliadinas se caracterizan por su alto contenido en prolina, que les confiere resistencia a la degradación por las enzimas digestivas, algunos autores han propuesto el uso de prolilendopeptidasas (PEP) bacterianas para facilitar su hidrólisis.
Estudios de perfusión de asas de intestino de rata mostraron la desaparición de péptidos intactos en presencia de PEP aunque no pudo excluirse la persistencia de péptidos residuales pero aún inmunogénicos; pero el efecto de las PEP sobre el transporte y procesamiento de la gliadina por la mucosa intestinal en pacientes con EC no fue abordado en esos estudios. Los mismos autores demostraron recientemente que el transporte transcelular anormal en pacientes con EC permite la entrada en la mucosa intestinal del péptido intacto 31-49 y de epitopes inmunoestimuladores derivados del péptido 56-88.
Fue así necesario verificar que las PEP puedan abolir el transporte transepitelial de estos péptidos de gliadina que ejercen supuestas funciones complementarias en la patogenia de la EC. A fin de determinar la cinética y concentración de PEP necesaria pa ra la degradación total de péptidos 31-49 y 56-88 se marcó a estos últimos con ³H y los metabolitos residuales fueron detectados con cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) e identificados por espectrometría de masa.

El efecto de la PEP sobre el transporte intestinal y el procesamiento de ambos péptidos fue además estudiado ex vivo mediante preparados de biopsia de duodeno de pacientes con EC montados en cámaras de Ussing. Finalmente se analizó la actividad y resistencia de las PEP a pH extremo y a la degradación por pepsina y tripsina.

Material y métodos
Los péptidos de gliadina 31-49 y 56-88 fueron sintetizados reemplazando la prolina por 3-4 deshidroprolina y luego marcados isotópicamente con ³H. La técnica no modifica la estructura original del péptido y el marcado isotópico permite su monitoreo durante el transporte intestinal. La PEP, obtenida de Flavobacterium meningosepticum, fue adquirida en un laboratorio local.
Se incubaron los péptidos 31-49 o 56-88 (0.2 mg/ml) en solución Ringer a 37ºC con diferentes concentraciones de PEP. Las reacciones se detuvieron por congelación a -80° C a diferentes tiempos entre 10 minutos y 24 horas. El análisis de péptidos y metabol itos se efectuó por RP-HPLC.
Con el fin de caracterizar el transporte intestinal de gliadina también se estudiaron 7 pacientes con EC activa, 2 con EC en remisión con dieta sin gluten, y 2 sin EC que fueron sometidos a biopsia intestinal por diversas causas y que presentaban histolo gía intestinal normal. El estudio fue aprobado por un comité de ética local y los participantes firmaron su consentimiento informado.
Se montaron en cámara de Ussing con un área de exposición de 0.025 cm² 2 a 6 especímenes de biopsia duodenal de cada paciente. Dichos preparados se bañaron de cada lado con 1.2 ml de solución de Ringer con control termostático, oxigenada y man tenida a pH 7.4 mediante burbujeo de gas carbónico. Las soluciones serosa y mucosa se conectaron a electrodos mediante puentes de agar con el fin de monitorear la diferencia de potencial transmural, la corriente de cortocircuito y la resistencia eléctric a. Los preparados provenientes de biopsias de pacientes con EC activa presentaban resistencia eléctrica más baja que los de los otros dos grupos. El agregado de PEP no modificó este parámetro, lo que sugiere ausencia de toxicidad para la mucosa intestina l.
El flujo epitelial se cuantificó en sentido mucosa a serosa, de los péptidos marcados isotópicamente. Los péptidos no marcados se agregaron al lado mucoso a una concentración final de 2 mg/ml con el añadido de 50 µCi de péptido marcado con ³H.
Junto con el péptido se agregó en la solución mucosa, PEP a diferentes concentraciones finales (20, 500, o 1 000 mU/ml). El flujo del péptido ³H se calculó contando la radioactividad de 10 µl de los compartimentos mucoso y seroso al final de cada experimento. Los epitopes generados durante el transporte intestinal se analizaron por RP-HPLC.
Los péptidos y metabolitos formados luego de la incubación in vitro con
PEP (estudios in vivo) o que se hallaban presentes en los compartimientos mucoso y seroso de las cámaras de Ussing (estudios ex vivo) se analizaron por RP-HPLC.
Se usó una columna WRP (250 mm) de sílice y un sistema de HPLC acoplado a un contador en línea para detección de radiactividad.
Para determinar la secuencia de fragmentos retenidos luego de la digestión in vitro de los péptidos 31-49 y 56-88 por PEP debido a la muy pequeña cuantía de péptidos rescatados en el compartimiento seroso de los especímenes de biopsia se utilizó e spectrometría de masa. La actividad de PEP se analizó por ensayo enzimático luego de la incubación in vitro de diferentes concentraciones de PEP (20, 100, 500, y 1 000 mU/ml) con pepsina (pH: 1.8) y tripsina (pH: 7.4) así como luego de la incubaci ón a pH 1.8 por 4 horas.

Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como media ± desvío estándar. Las comparaciones entre grupos se efectuaron mediante análisis de varianza o las pruebas no paramétricas de Wilcoxon y Kruskal-Wallis. Se consideraron estadísticamente significativos valores de p < 0.05.

Resultados
Tras la incubación con PEP se observó una cinética dependiente de la dosis en la velocidad y porcentaje de degradación de los péptidos 31-49 y 56-88. Un 40% y 100% de péptido 31-49 fue degradado luego de 4 y 24 horas, respectivamente, del agregado de 40 µU/ml de PEP, en tanto que el péptido 56-88 permaneció intacto por más de 24 horas.
En presencia de 20 mU/ml de PEP el péptido 31-49 desapareció dentro de los 30 minutos, mientras que el péptido 56-88 lo hizo más lentamente (50% de degradación en 1 hora y cerca del 100% a las 2 horas). A concentraciones de PEP de 100 mU/ml, el péptido 3 1-49 desapareció dentro de los 10 minutos; se necesitaron concentraciones de 500 mU/ml para digerir al péptido 56-88 dentro del mismo período.
El análisis por espectrometría de masa de los metabolitos recuperados del péptido 31-49 que habían sido detectados por HPLC sirvió para descubrir la presencia de un metabolito tóxico (secuencia 31-42), entre otros. Los estudios de transporte intestinal y procesamiento de péptidos 31-49 y 56-88 efectuados con marcación radioisotópica mostraron que la PEP en el compartimiento mucoso produjo un incremento significativo, dependiente de la concentración, en el flujo de ambos péptidos (31-49 y 56-88) en senti do mucosa a serosa respecto del flujo en ausencia de PEP en pacientes con EC activa.
El análisis de los péptidos y sus metabolitos mediante HPLC mostró que la PEP favoreció la hidrólisis del péptido 31-49. En el compartimiento mucoso, 20 mU/ml de PEP condujeron a degradación y posterior recuperación de metabolitos de este péptido (10% co mo ³H prolina y 90% como metabolitos intermedios). En el compartimiento seroso el 50% del péptido se degradó a ³H prolina mientras que el 50% fue recuperado como metabolitos intermedios con un 30% de estos que correspondió a la frac ción tóxica 31-42. Se requirieron concentraciones muy altas de PEP (500 mU/ml) para inhibir en forma total el transporte de fragmentos tóxicos. Al analizar estas características para el metabolito 56-88 se obtuvieron resultados similares.
En los individuos sin EC, así como en los portadores de EC tratados con dieta sin gluten, ambos péptidos fueron completamente degradados durante el proceso de transporte a través del epitelio intestinal. No se observaron alteraciones en la actividad de P EP tras dos incubaciones sucesivas de 4 horas cada una, con pepsina y tripsina. Ello sugiere que la PEP puede administrarse oralmente y alcanzar la luz intestinal sin inconvenientes. Igualmente, la actividad de la PEP fue abolida casi completamente a pH 1.8 pero restaurada con el retorno a pH neutro.

Discusión
El presente estudio confirma la capacidad de destoxicación para los péptidos de gliadina por parte de la PEP, pero pone en duda su eficacia en pacientes con EC. Diversos estudios demostraron que la mucosa de los pacientes con enfermedad celíaca proce sa inadecuadamente la gliadina y se comunicó una expresión deficiente de enzimas de ribete en cepillo en estos pacientes. Los autores del presente trabajo confirman que los péptidos de gliadina son degradados totalmente en pacientes con EC que reciben tr atamiento así como en controles sanos, mientras que ello no ocurre en pacientes con EC activa.
Dado que la prolina confiere a los péptidos de gliadina gran resistencia a su digestión intraluminal y en el ribete en cepillo, se propuso recientemente el uso de PEP a fin de degradar los péptidos de gliadina ricos en prolina. Si bien las PEP endógenas tienen poco impacto en la digestión de la gliadina, dado que ésta es preponderantemente citosólica, el procesamiento normal de las proteínas ingeridas tiene lugar en los compartimientos endolisosómicos. Diversos estudios mostraron que la PEP es capaz de degradar derivados de la gliadina muy resistentes a la digestión y que contienen un concatémero de 3 epitopes de células T que estimulan notablemente las células T CD4⁺.
En el presente estudio se evaluó el efecto de la PEP sobre dos péptidos capaces de desencadenar la inmunidad adaptativa y que juegan un papel complementario en la patogénesis de la EC. Los resultados de los estudios in vitro e in vivo indic an que la digestión de la gliadina depende de la concentración de PEP y que 33-mer es más resistente a la degradación que el péptido 31-49, y esto probablemente se deba a una mayor longitud del primero.
A concentraciones bajas de PEP se forman metabolitos potencialmente tóxicos derivados de ambos péptidos en tanto que se necesitan concentraciones de PEP de al menos 100 mU/ml y tiempos de exposición largos (3 h) para conseguir su degradación completa. Lo s estudios en preparados de biopsia de duodeno de pacientes con EC mostraron una degradación mayor de los péptidos 31-49 y 56-88 en los estudios ex vivo que en aquellos in vitro, hecho que sugiere un efecto hidrolítico colaborador entre las peptidasas del ribete en cepillo y las PEP.
También se sugirió, a partir de los resultados de los mismos experimentos, que 1 cm² de mucosa intestinal puede absorber 5 µg de fragmentos inmunoestimulantes en 1 hora en pacientes con EC activa en tanto que 1 µmol/l de péptido 56-88 fue sufi ciente para estimular células T policlonales de intestino humano de pacientes con EC.
Cálculos estimativos relacionados con la cinética del transporte intestinal de péptidos 33-mer y 9-31-49 y sus metabolitos sugieren que las concentraciones alcanzadas durante este proceso pueden ser suficientes para ejercer toxicidad y surge del presente estudio que los péptidos intactos o sus fragmentos inmunogénicos pueden atravesar la mucosa antes de ser completamente hidrolizados por las PEP.
Los autores aseveran también que es dificultoso estimar la dosis teórica necesaria para degradar totalmente el gluten en una dieta normal, aunque sugieren que la relación enzima/péptido óptima es cercana a 1/10. Esta dosis debería ser mayor si se conside ra el efecto “dilucional” ejercido por las secreciones intestinales, así como debe tenerse en cuenta que los trastornos de la motilidad esofágica y gastrointestinal, habitualmente presentes en pacientes con EC, pueden tener impacto sobre la digestión de gluten.
La eficacia de la PEP depende fuertemente de su arribo y disponibilidad en el intestino delgado, sitio donde deben ejercer su efecto. Los resultados provistos por los autores y que surgen de los estudios in vitro muestran que la PEP es resistente a la degradación por enzimas del jugo gástrico y pancreático y sugieren que la administración oral es suficiente para que la PEP alcance el intestino delgado en su forma activa.
Finalmente, concluyen que la PEP en altas concentraciones y luego de un largo tiempo de exposición podría ser eficaz para digerir los péptidos de gliadina y proponen su uso como complemento de la dieta pobre en gluten para el tratamiento de pacientes con diagnóstico de EC.

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