PRIMEIRO DESCRIÇAO DE M. KYORINENSE FORA DO JAPAO (FUERA DE JAPÓN)

Paulo Cesar De Souza Caldas¹,Carlos Eduardo Dias Campos²,Hiroaki Ohnishi³,Takashi Watanabe⁴,Kouki Ohtsuka Ohtsuka⁵,Satsuki Matsushima⁶,Fátima Cristina Onofre Fandinho Montes⁷,Teca Calcagno Galvão⁸ y Jesus Pais Ramos⁹

¹Biologo, Pesquisador, Centro De Referencia Prof. Helio Fraga/ensp-fiocruz.
²Biólogo, Pesquisador, Centro De Referencia Prof. Helio Fraga/ensp-fiocruz.
³Médico, Medico, Department Of Laboratory Medicine, Kyorin University School Of Medicine, Tokyo, Japan
⁴Medico, Medico, Department Of Laboratory Medicine, Kyorin University School Of Medicine, Tokyo, Japan
⁵Medico, Department Of Laboratory Medicine, Kyorin University School Of Medicine, Tokyo, Japan
⁶Medico, Department Of Laboratory Medicine, Kyorin University School Of Medicine, Tokyo, Japan
⁷Biólogo, Pesquisador, Centro De Referencia Prof. Helio Fraga/ensp-fiocruz.
⁸Biólogo, Pesquisador, Centro De Referencia Prof. Helio Fraga/ensp-fiocruz.
⁹Biólogo, Pesquisador, Centro De Referência Prof. Helio Fraga/ensp-fiocruz., Rio De Janeiro, Brasil

Rio De Janeiro, Brasil (SIIC)

Descreve-se, pela primeira vez no Brasil, cepas de M. kyorinense isoladas de espécimens clínicos. O seqüenciamento de diferentes alvos genéticos e a construção de uma árvore concatenada permitiram a identificação das cepas brasileiras como M. kyorinense.

O trabalho descreve, pela primeira vez no (describe, por primera vez en) Brasil, cepas de Mycobacterium kyorinense isoladas de espécimens clínicos. Essa é uma espécie descrita em 2009, até então, apenas relatada no (hasta ese momento, sólo informada en) Japão. Os testes (Las pruebas) bioquímicos realizados, o seqüenciamento de diferentes alvos genéticos e a construção de uma árvore (blancos genéticos y la construcción de un árbol) concatenada, construída através do método neighbor-joining, permitiram a identificação das cepas (de los linajes) brasileiras como M. kyorinense.

As ferramentas (Las herramientas) moleculares são cada vez mais (son cada vez más) utilizadas em estudos taxonômicos envolvendo (que involucran) micobactérias, sendo o sequenciamento (y el secuenciamiento es) reconhecido como instrumento importante na sua identificação (para su identificación), especialmente dos gene 16S rDNA e hsp65. Recentemente, a análise de vários genes combinados tem sido utilizada em (ha sido usada en) estudos filogenéticos e proporciona uma base molecular mais precisa para a identificação de espécies. Como reflexo da (Como reflejo de la) utilização dessas novas metodologias o número de espécies descritas de micobactérias não causadoras (no causantes) de tuberculose (MNT) vem crescendo recentemente de forma significativa. Atualmente o gênero Mycobacterium conta com mais de 150 espécies descritas.

Mycobacterium kyorinense é uma micobactéria não pigmentada (no pigmentada), que apresenta crescimento lento (que presenta crecimiento lento), descrita por Okazaki et al. em 2009 a partir de três pacientes, dois deles com doença (dos de ellos con enfermedad) pulmonar. Esta espécie é filogenéticamente relacionada às (a las) 8ª espécies M. celatum e M. branderi, descritas, respectivamente por Butler et al. em 1993 e por Koukila-Kähkölä et al. em 1995. Todas as cepas de M. kyorinense relatadas, até então (hasta ese momento), haviam sido unicamente relatadas de especimens de pacientes no Japão e é considerada uma espécie potencialmente causadora de doença respiratória.

O objetivo deste trabalho é apresentar a (es presentar la) primeira descrição de cepas de M. kyorinense no Brasil e, também a primeira fora do Japão, e caracterizar seu perfil de restrição quanto à (de restricción respecto a la) metodologia da PCR e análise de restrição enzimática do gene hsp65 (PRA-hsp65).

Este estudo inclui duas cepas (incluye dos linajes), HF1629 e HF1836, obtidas a partir de escarro de um (obtenidas del esputo de un) paciente oriundo do município de Barra do Piraí, Rio de Janeiro, Brasil. Estas amostras foram (Estas muestras fueron) inicialmente identificadas através do método PRA-hsp65 no Laboratório de Referência Nacional para a Tuberculose do Centro de Referência Professor Hélio Fraga/ENSP/FIOCRUZ, em 2007, como M. celatum tipo 2, em função deste ser padrão mais (por este ser el patrón más) próximo, disponível no PRAsite, naquela data (en aquella fecha).

A amplificação e a digestão de (La amplificación y la digestión de) fragmentos do gene hsp65 (441pb) foram realizados como descrito por Telenti et al. (1993) e o padrão de restrição resultante foi comparada com a base de dados (se comparó con la base de datos) existente no PRAsite (http://app.chuv.ch/prasite/index.html). Foi realizado o sequenciamento parcial do gene hsp65 e completo dos genes rpoB e 16S. Todas as sequências obtidas (obtenidas) foram comparadas quanto a identidade com sequencias de referência disponíveis no GeneBank, utilizando a ferramenta (la herramienta) BLAST, disponível no site http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. As sequencias desses três (Las secuencias de estos tres) genes foram utilizadas também para a produção de uma árvore concatenada, construída através da metodologia neighbor-joining, utlizando-se o programa MEGA 5. Foram também realizados testes (También se realizaron pruebas) bioquímicos e microbiológicos, necessários para a distinção das cepas das espécies relacionadas.

A análise das sequencias dos (El análisis de las secuencias de los) genes hsp65 e rpoB das cepas HF1629 e HF1836, através da ferramenta BLAST, revelou que suas sequencias têm 100% de identidade com a sequência da cepa tipo de M. kyorinense KUM060204. Os níveis de (Los niveles de) identidade do gene 16S rDNA, quando comparadas, com as cepas tipo (al ser comparadas con los linajes tipo), foram os seguintes: M. kyorinense KUM060204 99.73%, M. celatum ATCC51131 98.28% e M. branderi ATCC51789 97.9%. A árvore filogenética concatenada revelou que a linhagem HF1629 foi agrupada, em um mesmo ramo (com valor de bootstrap igual a 100) com a cepa tipo de M. kyorinense KUM060204. Esse grupo se mostrou distinto daqueles os quais foram (Ese grupo fue distinto de aquellos en que se agruparon) agrupados M. celatum, M. branderi e todas as sequências testadas.

Os testes bioquímicos e microbiológicos realizados com as cepas HF1629 e HF1836 apresentaram resultados concordantes com os apresentados pela (con aquellos presentados por la) cepa tipo de M. kyorinense KUM060204 e permitiram distinguir as cepas HF1629 e HF1836 das cepas tipo de M. celatum ATCC51131 e M. branderi ATCC51789.

A restrição enzimática do produto da PCR do ADN das cepas HF1629 e HF1836 produziu (produjo) fragmentos de 230, 130 e 80 pb (BstEII), e 125, 105, 80 pb (HaeIII). Esse novo perfil foi depositado no PRAsite, como M. kyorinense tipo 1, tendo como cepas de origem a (y tenía como linaje de origen la) cepa tipo dessa espécie KUM 060204 (que também não constava no banco de dados desse site) (en el banco de datos de ese sitio) e a cepa HF 1629.

Todos os resultados dos nossos experimentos nos levaram a concluir que as (nos permiten concluir que las) cepas HF1629 e HF1836 são uma mesma linhagem e exemplares da (son un mismo linaje y ejemplares de la) espécie M. kyorinense.

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