EVALUACIÓN COMPARATIVA DE DOS MEDIOS PARA HEMOCULTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS

Raisa Zhurbenko¹,Dennis Someillan Iglesias²,Adelaida Ortega Suris³,Yudisleidy López Ricardo⁴,Ana Mirtha Blanco González⁵,Mailin Torres Ortega⁶,Marcia Hart Cásares⁷,Ana Iris Brito González⁸ y Claudio Rodríguez Martínez⁹

¹Doctora en Ciencias Técnicas, Investigadora Titular, Jefa de Proyecto de Investigación, Centro Nacional de Biopreparados, Bejucal, Cuba
²Licenciado en Ciencias de la Salud, Tecnólogo de Avanzada, Centro Nacional de Biopreparados, Bejucal, Cuba
³Licenciada en Ciencias de la Salud, Especialista para la Ciencia y Tecnología, Centro Nacional de Biopreparados, Bejucal, Cuba
⁴Licenciada en Biología, Aspirante a Investigadora, Centro Nacional de Biopreparados, Bejucal, Cuba
⁵Licenciada en Servicios en Microbiología, Hospital Docente Clínico Quirúrgico Miquel Enríquez, La Habana, Cuba
⁶Técnico en Servicios en Microbiología, Hospital Docente Clínico Quirúrgico Miquel Enríquez, La Habana, Cuba
⁷Doctora en Microbiología, Hospital Clínico Quirúrgico Hermanos Ameijeiras, La Habana, Cuba
⁸Licenciada en Ciencias de la Salud, Investigadora Agregada, Centro Nacional de Biopreparados, Bejucal, Cuba
⁹Ingeniero Tecnólogo, Investigador Titular, Centro Nacional de Biopreparados, Bejucal, Cuba

Bejucal, Cuba (SIIC)

Los resultados obtenidos muestran el satisfactorio desempeño del HemoCen Aerobio y su equivalencia con el medio de referencia, lo que hace a este diagnosticador muy útil para detectar bacteriemias provocadas por microorganismos. La sensibilidad, especificidad y exactitud diagnósticas resultaron ser 91.6%, 98.7% y 97.0%, respectivamente. Se detectó una positividad total de 20.7% y se logró aislar e identificar Staphylococcus aureus, Escherichia coli, levaduras, Acinetobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Serratia marcences y Acinetobacter calcoacetium anitratum.

Introducción
La bacteriemia es una entidad clínica que ocasiona una importante y creciente morbimortalidad, que varía entre el 18% y el 60%.^1-6
La bacteriemia y la fungemia constituyen complicaciones graves de las infecciones causadas por microorganismos. Los estudios multicéntricos retrospectivos muestran que el 80% de ellas son causadas por catéteres.⁷ Las bacteriemias y las fungemias se producen cuando los microorganismos invaden el torrente sanguíneo y se multiplican a un ritmo que supera la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlos. La presencia de microorganismos se detecta inoculando la muestra de sangre en un frasco de hemocultivo.
Los hemocultivos son considerados aún como el gold standard para la detección de los patógenos relacionados con la bacteriemia y la sepsis,^8-10 a pesar de la existencia de las nuevas técnicas moleculares, que requieren más estudios antes de recomendarlos como un reemplazo de los hemocultivos habituales.^11,12
Los métodos con utilización de los medios para hemocultivos permiten la identificación microbiana y los ensayos de susceptibilidad como componentes críticos de una sepsis, a pesar de su duración en el tiempo y la sensibilidad disminuida para detectar los patógenos exigentes.¹³ Los estudios realizados por Beltrán y colaboradores¹⁴ revelan una mortalidad por infecciones de 33.2% y de 29.6% en los pacientes con un tratamiento antibiótico empírico inapropiado. La detección de microorganismos en sangre en el menor intervalo de tiempo constituye una herramienta valiosa para la aplicación de una terapia antimicrobiana oportuna en los pacientes con alto riesgo de padecer enfermedades que ponen en peligro la vida.¹⁵
HemoCen Aerobio es un nuevo diagnosticador para hemocultivos en adultos del Centro Nacional de Biopreparados (BioCen, Cuba) compuesto de un medio de cultivo de enriquecimiento general, líquido, listo para su uso, diseñado para potenciar el metabolismo y promover el desarrollo de las especies de microorganismos aerobios exigentes a partir de muestras de sangre. Este medio basa la promoción del crecimiento en la inclusión del caldo triptona soja, enriquecido con otras bases nutritivas, como el extracto de Ipomoea batatas, que aporta glúcidos y vitaminas al medio.¹⁶ Contiene, además, otros factores de crecimiento y vitaminas y polianetol sulfonato de sodio (SPS), con actividad anticoagulante, antifagocitaria de los eritrocitos, anticomplementaria y de inactivación de polipéptidos (polimixina) y aminoglucósidos (estreptomicina, kanamicina, gentamicina).
El objetivo de la investigación consistió en el estudio comparativo multicéntrico de validación de HemoCen Aerobio y un medio comercial para hemocultivos para el aislamiento de microorganismos aerobios.

Materiales y métodos
Organización del estudio
Se realizó una evaluación comparativa de HemoCen Aerobio para su uso en adultos, producido en condiciones asépticas industriales, envasado en frascos de vidrio transparentes, con tapón de clorobutilo, sello metálico y cierre flip off, con etiquetas transparentes, con el medio comercial para hemocultivos (Liofilchem, Italia) como medio de referencia. El estudio se ejecutó en dos hospitales de La Habana: Hospital Docente Miguel Enríquez (HDME) y Hospital Clínico-Quirúrgico Hermanos Ameijeiras (HCQHA) y abarcó 103 muestras provenientes de pacientes de ellas 81 de HDME y 22 de HCQHA.
Las características demográficas de la población estudiada y de las bacteriemias registradas se presentan en la Tabla 1.

Procedimiento para la toma de muestra
Antes de procesar cada muestra, se conoció el estado del paciente (diagnóstico presuntivo y terapia antimicrobiana aplicada, entre otros aspectos). Para la extracción de la sangre y su inoculación en el frasco se tomaron las precauciones plasmadas en las buenas prácticas de laboratorio clínico.¹⁰ Con guantes estériles y manteniendo las condiciones de asepsia se comprobó el estado de los frascos, observando visualmente cualquier alteración macroscópica del medio. Seguidamente se desinfectó la piel en el sitio donde se realizaría la punción para extraer la sangre y en sus alrededores con alcohol isopropílico al 70% (p/v), y con solución de yodo-povidona. Una vez desinfectado el sitio, se retiró el protector del casquillo del frasco y se desinfectó el tapón con solución de yodo-povidona. Para la extracción de la sangre se utilizaron las jeringuillas estériles. Se ventiló el frasco antes de adicionar la muestra, perforando el tapón con una aguja estéril. Se extrajo la sangre (20 ml), utilizando los guantes estériles y se transfirió el contenido a los frascos perforando el tapón e inyectando asépticamente (10 ml al frasco HemoCen Aerobio, y después de cambiar la aguja, otros 10 ml al frasco de control).¹⁷ Con posterioridad se limpió la piel del paciente en el punto de extracción con alcohol isopropílico al 70% (p/v). Se mezcló el contenido de los frascos con la sangre, volteándolos varias veces. Los frascos se rotularon con la información del paciente y se colocaron en la incubadora (Heraeus, Alemania) a 35°C ± 2°C. A las 24 horas de incubación se realizó la primera resiembra de todos los hemocultivos a los medios agar sangre, agar chocolate y agar de MacConkey (todos de BioCen, Cuba). De no observar los signos macroscópicos de crecimiento microbiano (turbidez del medio, hemólisis, producción de gas, aparición de sangre “achocolatada”, de colonias, o la formación de una capa de crecimiento en la superficie,¹³ en los frascos de hemocultivos durante 24 horas, se continuó su incubación por un período de siete días a temperatura de 35°C ± 2°C, con las resiembras a las 48 y 72 horas en los medios mencionados. A los microorganismos aislados en los medios de resiembra se les realizó la tinción de Gram y la identificación final se completó con pruebas bioquímicas (oxidasa, catalasa, coagulasa, indol, PYR, DNasa, galactosidasa, producción de lecitinasa, fermentación de lactosa, urea, producción de sulfuro de hidrógeno, fenilalanina desaminasa y lisina decarboxilasa.¹³
La existencia de los cultivos contaminados se comprobó por medio de hemocultivos seriados.

Características funcionales
Con los resultados del estudio se calcularon los indicadores diagnósticos relativos previstos en las guías de validación de métodos microbiológicos alternativos tales como la sensibilidad (S), la especificidad (E) y la exactitud diagnóstica (ED) después de la etapa de confirmación.^18,19 En esta etapa se ejecutó el análisis final de desempeño clínico, es decir después de haber confirmado con pruebas bioquímicas adicionales la presencia verdadera o la ausencia de microorganismos diana en las muestras. Como resultado de la confirmación con las pruebas bioquímicas, los resultados discrepantes entre HemoCen Aerobio y el medio de referencia fueron confirmados y se mantuvieron como falsos positivos o falsos negativos o fueron convertidos para HemoCen Aerobio en verdaderos positivos o verdaderos negativos según establece la norma de validación.¹⁹
Finalmente, se determinaron los parámetros de desempeño clínico del medio para hemocultivo aerobio de la firma Liofilchem (referencia), de manera similar.

Análisis estadístico
Para comprobar estadísticamente si los métodos comparados presentaban diferencias en cuanto a su funcionalidad, se aplicó la prueba de McNemar para un valor de alfa = 0.05, previsto en la norma de validación de métodos microbiológicos alternativos para los casos en que se detectan más de seis desacuerdos entre ambos procedimientos.¹⁹ El intervalo de confianza se calculó según dicha norma para el 95% de probabilidad, para una cola, en el caso que el valor de los parámetros “p” fuera superior al 90%.¹⁹
Se calculó el índice Kappa, que refleja la fortaleza de los acuerdos entre ambos métodos y los valores predictivos de los positivos y de los negativos.¹⁹
Las proporciones de probabilidad de un diagnóstico positivo y de un diagnóstico negativo se calcularon según la Regulación N° 47-2007 del CECMED.¹⁸

Resultados
En el estudio comparativo del desempeño del HemoCen Aerobio para el uso en adultos y el medio de referencia, realizado con muestras procedentes de los pacientes con diferentes afecciones y de personas aparentemente sanas, en dos centros hospitalarios de La Habana (Tabla 2), se pudo constatar que de las 103 muestras evaluadas, dos (para un 1.9%) resultaron contaminadas en ambos medios con Staphylococcus coagulasa negativo (SCN) procedente de la piel, por lo cual fueron desechadas.

Otras 22 muestras resultaron verdaderas positivas (presencia de microorganismos diana) para un 21.8% en el medio HemoCen Aerobio y 19 muestras fueron positivas en el medio comercial (18.8%).
Se encontraron siete discrepancias en los resultados entre el medio HemoCen Aerobio y el de referencia. De ellas, se obtuvieron cinco resultados positivos con el HemoCen Aerobio, mientras que en el de referencia se detectaron dos muestras positivas que no fueron detectadas con el medio de BioCen.
En HemoCen Aerobio y en el medio para hemocultivo comercial se pudo aislar e identificar un universo amplio de microorganismos (Tabla 2), entre ellos, en orden respectivo: Staphylococcus aureus, 50.0% y 36.8%; Escherichia coli, 13.6% y 15.8%; levaduras, 4.5% y 10.5%; Acinetobacter spp., 9.0% y 10.5%; Klebsiella pneumoniae, 9.0% y 10.5%; Serratia marcences, 9.0% y 10.5%, y Acinetobacter calcoacetium anitratum, 4.5% y 5.3%.
Un total de 76 muestras (75.2%) fueron verdaderas negativas y dos falsas negativas (2%) en el medio HemoCen Aerobio (Figura 1). Estas últimas no desarrollaron el crecimiento microbiano en el HemoCen Aerobio; sin embargo, en el medio comercial de referencia se observaron células levaduriformes. Por otra parte, una muestra fue positiva para levadura y otras cuatro muestras posibilitaron la detección de S. aureus, en el medio HemoCen Aerobio, resultando estas cinco muestras negativas en el medio de referencia estudiado. En una muestra se observó sangre “achocolatada” en ambos diagnosticadores, sin comprobar la presencia de microorganismos en ella, por lo que fue considerada como un valor falso positivo.

La Figura 2 recopila los indicadores diagnósticos relativos (clínicos) obtenidos en el estudio comparativo de evaluación del desempeño, calculados a partir de los resultados de la fase de confirmación de la presencia de microorganismos.

Los valores de los indicadores diagnósticos relativos resultaron elevados: la sensibilidad, la especificidad y la exactitud diagnóstica alcanzaron 91.6%, 98.7% y 97.0%, respectivamente (Figura 2).
Los valores predictivos de los resultados positivos y negativos del HemoCen Aerobio fueron igualmente adecuados y superiores ambos al 95% (Figura 2), lo que brinda confianza en la capacidad para diagnosticar adecuadamente la presencia de microorganismos causantes de enfermedades en personas afectadas que realmente son portadores de estos agentes patógenos.
Por último, las proporciones que representan la probabilidad de un diagnóstico positivo son elevadas y las del diagnóstico negativo reducidas. Ambos resultados se consideran adecuados. Este hallazgo era de esperar como se desprende de los anteriores resultados, pero es un elemento más que conforma el conjunto de herramientas para evaluar el comportamiento de un diagnosticador.
La aparición de reacciones características del crecimiento microbiano en el tiempo en el medio HemoCen se enmarca en la duración del período de incubación (hasta siete días).
Al aplicar la prueba de McNemar, se pudo comprobar que el menor número de discrepancias (m = 2 discrepancias negativas) resultó ser superior que el mayor número de discrepancias posibles según la tabla de MacNemar (M = 0), concluyendo con ello que ambos métodos no difieren uno de otro.
El resultado de todos los parámetros comparativos del desempeño diagnóstico de HemoCen Aerobio con respecto al medio para hemocultivo aerobio comercial de referencia empleado en el estudio comparativo, permite afirmar que ambos medios son equivalentes.

Discusión
La contaminación de hemocultivos se debe, fundamentalmente, a la presencia de SCN al momento de la obtención de la muestra.^20,21 El porcentaje de hemocutivos contaminados por SCN se encuentra por debajo del valor informado para las contaminaciones de estos cultivos hasta 3%.^22,23
El bajo porcentaje de hemocultivos contaminados disminuye el grado de confusión con respecto a la necesidad de la terapia antimicrobiana.²⁴ Por otra parte, se conoce que los costos de hemocultivos contaminados superan a menudo a los costos de ensayos.²⁵ Es por ello que se están implementando varias estrategias para reducir los hemocultivos contaminados. Una de ellas es la producción industrial de estos diagnosticadores listos para su uso, lo que garantiza homogeneidad en su calidad debido a los estrictos controles implementados en la industria.²⁶ La preparación de los frascos de HemoCen Aerobio en condiciones industriales favoreció la disminución de contaminación, coincidiendo con lo planteado por Rohner y Auckenthaler.²⁷
El porcentaje de positividad en ambos medios se encuentra entre los valores informados por varios autores desde 13.4%²⁸ hasta 37.8%.²⁹
En los últimos años se ha producido un cambio en la etiología de la bacteriemia nosocomial. Los principales microorganismos productores de infección intrahospitalaria, tales como los bacilos gramnegativos (Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. y Acinetobacter spp.), desde hace algunos años son superados en incidencia por los cocos grampositivos, fundamentalmente S. aureus y SCN y, en menor medida, por Streptococcus alfa-hemolíticos y Enterococcus spp.^30,31 En España, por ejemplo, los datos del Estudio de Prevalencia de las Infecciones Nosocomiales (EPINE)³² muestran que en el período 2001-2006 las infecciones por cocos grampositivos alcanzaron el 24% del total, seguidas por bacilos gramnegativos (10%).
La tasa de mortalidad por sepsis varía entre el 21% y el 55%² y permanece invariable en las últimas décadas. Los estudios realizados por Annane,³³ refieren que las bacterias grampositivas son la causa más frecuente de infecciones del tracto sanguíneo (del 30% al 50% del total de casos), seguidas de las bacterias gramnegativas (25% a 30%). Del 1% al 3% de los casos positivos los ocupan los hongos, y en al menos en un 30% no se identifica el patógeno causante.
De acuerdo con los estudios realizados por Weinstein y colaboradores,³⁴ los microorganismos patógenos aislados en más de 90% de los casos incluían S. aureus, Streptococcus pneumoniae, E. coli, otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
Varios autores refieren el comportamiento de los aislamientos de hemocultivos intrahospitalarios, con la mayor prevalencia de S. aureus (22% a 32.2%) y E. coli (8.5% a 16%),^14,29 resultados éstos similares a los obtenidos en el presente estudio; aunque Beltrán y colegas,¹⁴ para los 168 aislamientos de origen extrahospitalario estudiados, destacan como la especie de más frecuencia E. coli (19.6%), seguida por S. aureus (17.3%), S. pneumoniae (14.9%), SCN (10.1%) y otros.
Otros artículos científicos muestran que las especies de estafilocos y S. aureus se consideran como la mayor preocupación, tanto en la medicina, como en la seguridad alimentaria.³⁵
La detección de bacilos gramnegativos, como los miembros de la familia Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella spp. y Serratia spp.) se encuentra en correspondencia con los estudios realizados por estar presentes en más del 50% de las bacteriemias. Estos microorganismos son capaces de colonizar rápida y eficazmente la piel y el tracto gastrointestinal de los pacientes hospitalizados, lo cual, sumado a su resistencia relativamente alta a los antimicrobianos, se convierte en un factor de riesgo importante.³⁶
El porcentaje de falsos positivos coincide con los reportes existentes (hasta un 2%), en los cuales se encuentra un índice de crecimiento elevado sin conseguir aislar ningún microorganismo, se atribuye esto a la actividad de las células hemáticas. Aunque casi todos los hemocultivos positivos son considerados como significativos, pueden darse resultados falso positivos, cuya interpretación resulta crítica. La información clínica puede ayudar al laboratorio a decidir cuándo un aislamiento es más probable que sea considerado como un contaminante.¹³
Los resultados de la investigación muestran elevados valores de sensibilidad, especificidad y exactitud diagnósticas relativas (clínicas) de HemoCen Aerobio superiores al 90% y en especial, la especificidad y la exactitud, que rebasaron el 95%.
Aronson y Bor,³⁷ mediante ensayos simples de hemocultivos, refirieron como valores aceptables de sensibilidad por encima de 80% a 90%. A su vez, en los estudios de hemocultivos simultáneos, realizados por González-Ávila y Bello-Villalobos,³⁸ se obtuvieron valores de sensibilidad y especificidad de un hemocultivo transcatéter positivo con hemocultivo y periférico negativo de 87.5% y 97.9%, respectivamente, y con un valor predictivo de los positivos de 82.3% y un valor predictivo de los negativos de 98.6%. La presencia de un hemocultivo transcatéter negativo y periférico positivo mostró una sensibilidad de 62.5%, una especificidad de 99.3%, un valor predictivo de los positivos de 90.9% y de los negativos de 96%. Cuando ambos hemocultivos fueron positivos se identificó correctamente la infección en el 83.3% de los casos, con una sensibilidad de 93.7% y una especificidad de 93.9%.
Los nuevos sistemas se pueden considerar validados si detectan más de un 95% de microorganismos detectados por el sistema de referencia.³⁹ Tissari y colegas¹² reportaron 94.7% de sensibilidad y 98.8% de especificidad para los Prove-it sepsis assay (Mobidiag, Finlandia) basados en una plataforma de microarreglos de ADN.
Al comparar los valores de estos dos indicadores diagnósticos del HemoCen Aerobio con los del medio de referencia se observan valores superiores del diagnosticador objeto de estudio, en términos de sensibilidad, con respecto al medio de comercial de referencia, que mostró una sensibilidad clínica de sólo 78.3% al dejar de detectar cinco muestras realmente contaminadas. El análisis estadístico con el índice Kappa mostró una concordancia elevada entre los métodos, considerada como “casi perfecta” (0.81-1.0).⁴⁰
La ubicación inmediata de los frascos inoculados con las muestras en la incubadora permitió restar la influencia de las sustancias de la sangre tales como complementos, fagocitos y anticuerpos con actividad antimicrobiana.²⁴
La recuperación de los organismos de los hemocultivos se favoreció por la relación sangre-caldo de cultivo 1:10, según refieren los estudios realizados por Auckenthaler y colaboradores,⁴¹ en comparación con la relación 1:5. El volumen de medio en los frascos y su relación con el volumen de muestra recomendado para el grupo etario (adulto), posibilitaron atenuar el efecto inhibitorio de los antimicrobianos en las muestras y evitar la coagulación excesiva de la sangre.
El extracto de Ipomoea batatas puede haber influido en la detección de un mayor número de muestras con presencia de microorganismos, en comparación con el medio comercial.
La existencia de los falsos positivos en los hemocultivos se señala por diferentes autores, incluso para los sistemas automatizados. Por ejemplo, Cockerill III y su grupo⁴² refieren 1.3% de falsos positivos en hemocultivos realizados con el sistema BACTEC 9240 (Becton Dickinson, EE.UU.).
Los valores predictivos de los resultados positivo y negativo resultaron superiores al 80%-85%, lo que permite considerar esta prueba diagnóstica como competente, según los criterios de otros autores.⁴³ Un marcador de sepsis con alta sensibilidad y valor predictivo negativo permite detectar y tratar tempranamente a los pacientes con sepsis y disminuir con ello la mortalidad.^43,44
Los resultados de la investigación muestran el desempeño satisfactorio del HemoCen Aerobio para uso en adultos y su equivalencia con el medio ensayado como referencia, lo que hace a este nuevo diagnosticador muy útil para la detección de bacteriemias.

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